鱟試驗(yàn)法——用熒光測(cè)定檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素含量的方法介紹

將熒光母素（fluorescamine)加入鱟試劑中，可使參與凝膠反應(yīng)的蛋白分子被熒光素標(biāo)記上。在形成凝膠的過(guò)程中，由于蛋白分子產(chǎn)生聚合結(jié)構(gòu)變化，結(jié)合于蛋白的熒光素因部分蛋白隨水分子運(yùn)動(dòng)而同時(shí)發(fā)生旋轉(zhuǎn)，導(dǎo)致熒光偏光度發(fā)生變化。令熒光偏光度為P，垂直熒光強(qiáng)度為I₁，水平熒光強(qiáng)度為I₂，則可見(jiàn)Р值由于凝膠化而增加，其值可按下式求得如下圖:

Р值與標(biāo)本中內(nèi)毒素的含量呈線(xiàn)性關(guān)系。

實(shí)驗(yàn)時(shí)所用的熒光母素濃度常為0.02%。因?yàn)闊晒饽杆貪舛仍?.05%以上時(shí)，聚合反應(yīng)有明顯的抑制，0.025%有輕微的抑制作用。

鱟試劑凝膠化，可以使P值增大，其反應(yīng)潛伏期的長(zhǎng)短與P值增大的程度取決于內(nèi)毒素的濃度。當(dāng)內(nèi)毒素在10^-2μg/ml時(shí)，5分鐘內(nèi)P值開(kāi)始增大，而10^-3μg /ml時(shí)，則在30分鐘仍看不出P值的增大，當(dāng)內(nèi)毒素<10^-3μg /ml時(shí)，濃度越小潛伏期越長(zhǎng)。從而形成了P值上升的圖象，據(jù)此可求出回歸直線(xiàn)方程。

設(shè)傾斜度為b，潛伏期為t ，計(jì)算b/t值。如按不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素計(jì)算結(jié)果繪成曲線(xiàn)，可見(jiàn)內(nèi)毒素在10^-8～10^-3μg /ml范圍內(nèi)呈上升型直線(xiàn)，其相關(guān)系數(shù)為0.9804，方程式為:
Y = 0.0207 + 0.0797x
(R = 0.9804)

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，即可求出被檢標(biāo)本中內(nèi)毒素的含量。
本試驗(yàn)的操作均在0℃進(jìn)行，測(cè)定時(shí)則在25℃進(jìn)行。應(yīng)觀察60分鐘內(nèi)反應(yīng)的全過(guò)程，每隔5分鐘測(cè)定一次。