利用轉(zhuǎn)錄+蛋白聯(lián)合解析結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移藥物
結(jié)直腸癌 (Colorectal cancer, CRC) 在惡性腫瘤中發(fā)病率排第三，死亡率占據(jù)第二位，并且CRC肝轉(zhuǎn)移（CRCLM）的死亡率超過70%。目前常用于治療CRCLM的藥物是血管生成抑制劑貝伐單抗，然而，經(jīng)常出現(xiàn)先天性或獲得性耐藥導致治療失敗和癌癥復發(fā)。已有研究證明CRCLM能夠通過血管劫持（vessel co-option）過程產(chǎn)生耐藥，血管劫持過程指的是隨著時間的推移，腫瘤可學會“劫持”周圍組織的正常血管對藥物產(chǎn)生耐藥性，不過針對血管劫持機制的研究主要集中“劫持者”腫瘤細胞方向，而“被劫持者”竇狀毛細血管方向的作用機制還尚未探索。組學技術的快速發(fā)展和應用為復雜疾病的機制探究提供了便利，技術的革新更是將人類健康和疾病的研究推上了新的臺階。
2022年8月，來自暨南大學陳敏鋒、葉文才及張冬梅共同通訊在Journal of Clinical Investigation （IF=19）在線發(fā)表題為《Targeting FAPα-expressing hepatic stellate cells overcomes resistance to anti-angiogenics in colorectal cancer liver metastasis models》的研究成果，該研究整合轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學技術深度解析了靶向表達FAPα的肝星狀細胞可以克服結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移模型中抗血管生成藥物的耐藥性的分子機制。該研究發(fā)現(xiàn)貝伐單抗耐藥的腫瘤細胞成纖維細胞生長因子結(jié)合蛋白 1 (FGFBP1)上調(diào)表達，F(xiàn)GFBP1通過增強HSCs旁分泌FGF2-FGFR1-ERK1/2EGR1信號通路誘導FAPα表達，F(xiàn)APα促進肝星狀細胞（HSC）中CXCL5的分泌，從而激活CXCR2以促進腫瘤細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和募集骨髓來源的抑制細胞產(chǎn)生耐，通過靶向FAPα+ HSC能夠有效的破壞竇狀毛細血管的選定和克服貝伐單抗耐藥性。中科新生命為其提供了轉(zhuǎn)錄組學和TMT蛋白質(zhì)組學技術服務。
2022年8月，來自暨南大學陳敏鋒、葉文才及張冬梅共同通訊在Journal of Clinical Investigation （IF=19）在線發(fā)表題為《Targeting FAPα-expressing hepatic stellate cells overcomes resistance to anti-angiogenics in colorectal cancer liver metastasis models》的研究成果，該研究整合轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學技術深度解析了靶向表達FAPα的肝星狀細胞可以克服結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移模型中抗血管生成藥物的耐藥性的分子機制。該研究發(fā)現(xiàn)貝伐單抗耐藥的腫瘤細胞成纖維細胞生長因子結(jié)合蛋白 1 (FGFBP1)上調(diào)表達，F(xiàn)GFBP1通過增強HSCs旁分泌FGF2-FGFR1-ERK1/2EGR1信號通路誘導FAPα表達，F(xiàn)APα促進肝星狀細胞（HSC）中CXCL5的分泌，從而激活CXCR2以促進腫瘤細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和募集骨髓來源的抑制細胞產(chǎn)生耐，通過靶向FAPα+ HSC能夠有效的破壞竇狀毛細血管的選定和克服貝伐單抗耐藥性。中科新生命為其提供了轉(zhuǎn)錄組學和TMT蛋白質(zhì)組學技術服務。
研究材料
人結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移組織標本；結(jié)腸直腸癌細胞系；小鼠
技術路線
步驟1：貝伐單抗耐藥的CRCLM異種移植模型中血管選定的數(shù)量和FAPα蛋白的表達水平
步驟2：條件性敲除HSCs中FAPα基后探究影響血管選定過程原因
步驟3：研究FAPα對MDSC的招募和腫瘤轉(zhuǎn)移的影響
步驟4：探究FAPα促進血管選定的分子機制
步驟5：闡明結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者貝伐單抗耐藥的分子機制
結(jié)果部分：
人結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移組織標本；結(jié)腸直腸癌細胞系；小鼠
技術路線
步驟1：貝伐單抗耐藥的CRCLM異種移植模型中血管選定的數(shù)量和FAPα蛋白的表達水平
步驟2：條件性敲除HSCs中FAPα基后探究影響血管選定過程原因
步驟3：研究FAPα對MDSC的招募和腫瘤轉(zhuǎn)移的影響
步驟4：探究FAPα促進血管選定的分子機制
步驟5：闡明結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者貝伐單抗耐藥的分子機制
結(jié)果部分：
1、貝伐單抗耐藥的CRCLM異種移植模型中血管選定的數(shù)量和HSCs中FAPα基因的表達水平均升高
研究者通過異種移植貝伐單抗敏感的HCT116細胞到小鼠肝臟，然后使用10mg/kg的貝伐單抗處理42天產(chǎn)生耐藥模型，使用貝伐單抗耐藥的細胞HT-29作為對照組（Fig1 A）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在貝伐單抗耐藥組的病理學生長模式以RHGP為主要模式(Fig1 B)，并且免疫熒光結(jié)果顯示貝伐單抗獲得性耐藥的HCT116 CRCLM異種移植模型中發(fā)生血管選定（CD31+）的數(shù)量更多(Fig1 C)。通過進一步針對貝伐單抗耐藥組中出現(xiàn)血管選定的血管特征進行分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)APα蛋白主要在αSMA+ HSCs表達，而在對照組中無表達(Fig1 D)。這些結(jié)果提示結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移中血管選定導致貝伐單抗耐藥可能與HSCs中FAPα的表達有關。
2. FAPα誘導HSCs分泌CXCL5促進血管選定
研究者接下來探索了FAPα在HSCs中對血管選定的作用。結(jié)果顯示，F(xiàn)APα條件性敲除后血管選定的數(shù)量減少(Fig2 C)，GR-1+髓源性抑制性細胞的募集明顯受到抑制(Fig2 D)，CD8+T細胞的數(shù)量明顯升高(Fig2 E)，F(xiàn)APα條件性敲除后RT-PCR結(jié)果顯示間充質(zhì)細胞標志蛋白vimentin和N-cadherin的表達水平顯著下調(diào)，上皮細胞標志蛋白E-cadherin顯著上調(diào)，因此推測FAPα+HSCs可能是通過預先建立免疫抑制生態(tài)位，誘導腫瘤細胞EMT促進血管選定。
轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示，F(xiàn)APα基因過表達的肝星狀細胞系中分泌的細胞因子CSF2, IL18, CXCL5, IL33, IL1B以及 IL16的表達水平上調(diào)(Fig3 A)，并且通過RT-PCR對上述基因進行驗證，結(jié)果顯示IL18,CXCL5, IL33和IL1B與測序結(jié)果相符，并且CXCL5基因的表達水平升高的最為顯著(Fig3 B)；ELISA結(jié)果顯示在FAPα基因過表達的細胞系的培養(yǎng)基上清中CXCL5的含量也升高(Fig3 C)；結(jié)果提示FAPα可能與HSCs分泌CXCL5有關。因為腫瘤來源的CXCL5能夠通過激活CXCR2促進腫瘤細胞EMT和MDSC募集，因此研究者推測HSCs來源的FAPα可能通過CXCL5-CXCR2軸促進腫瘤細胞EMT和MDSC的募集，并最終通過一系列實驗驗證了猜想：FAPα誘導HSCs分泌CXCL5細胞因子激活CXCR2促進腫瘤細胞EMT和MDSC募集，從而促進血管選定。
3.腫瘤細胞源性FGFBP1能夠誘導HSCs表達FAPα促進血管選定
為探討HSCs表達FAPα促進血管選定的分子機制，研究者運用蛋白質(zhì)組學方法對貝伐株單抗敏感和耐藥的HCT116 CRCLM異種移植腫瘤進行了分析，結(jié)果顯示在貝伐單抗耐藥的腫瘤中檢測到17個上調(diào)表達的蛋白(Fig4 A)，并且通過RT-PCR確認FGFBP1基因表達水平也最為顯著(SFig4 A&B)。免疫組化染色、Western blotting和ELISA檢測顯示，在貝伐單抗耐藥的CRCLM異種移植體系（HCT116和HT-29）的腫瘤組織和原代細胞中FGFBP1均高表達(Fig4 B-D)。為探討FGFBP1對HSCs中FAPα表達和血管選定的作用機制，在HCT116細胞上構(gòu)建了FGFBP1基因過表達細胞系，在HT-29細胞上構(gòu)建了FGFBP1基因干擾表達細胞系，HE染色結(jié)果顯示過表達FGFBP1后RHGP的比率顯著升高，相反，干擾FGFBP1的表達之后RHGP的比率顯著降低(Fig4 E)。同時，在免疫熒光結(jié)果中過表達FGFBP1后血管選定的數(shù)量和陽性表達FAPα蛋白的HSCs數(shù)量也顯著增多，干擾之后數(shù)量就會減少(Fig4 F，G)。
4、FGFBP1能夠通過FGF2-FGFR1-ERK1/2-EGR1軸誘導HSCs表達FAPα蛋白
接下來，研究者針對FGFBP1誘導HSCs表達FAPα蛋白的機制展開探索，由于FGFBP1能夠通過細胞外基質(zhì)（ECM）釋放FGF2來增強FGFR1信號通路，所以研究者檢測了LX-2細胞系中FGF2和FGFR1的基因表達水平，發(fā)現(xiàn)其確實高于其他的FGFs和FGFRs（sFig6 A，B）。另外，F(xiàn)GF2和磷酸化的FGFR1在陽性表達FAPα蛋白的HSCs中表達水平升高（sFig6 C），說明FGFBP1可能是通過FGF2-FGFR1信號通路來誘導HSCs表達FAPα蛋白的。鑒于ERK1/2-EGR1軸位于FGFR1的下游，而EGR1能夠與FAP基因的啟動子結(jié)合誘導FAPα的表達，所以研究者認為FGFR1激活誘導HSCs中FAPα的表達可能受ERK1/2-ERG1軸的調(diào)控。因此研究者就通過WB檢測了FGFR1和ERK1/2的磷酸化狀態(tài)以及EGR1和FAPα的表達水平，發(fā)現(xiàn)FGFBP1過表達之后這些標志蛋白的表達水平均顯著上調(diào)（Fig5 A）。此外，敲除RGR1基因后FAPα的表達水平顯著下調(diào)（Fig5 D），進一步對研究的猜想進行了驗證。
緊接著，研究者通過一系列的細胞培養(yǎng)和分子生物學方法，進一步探究了FGF2-FGFR1-FAPα途徑在促進貝伐單抗誘導的血管選定的作用后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GFR1的激活可能是依賴于FAPα誘導HSCs分泌趨化因子CXCL5促進腫瘤細胞的EMT和MDSC招募，從而促進血管選定過程。并且這一結(jié)果也在臨床結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的標本中進行了驗證，此外，該研究的最后使用了研究者實驗室合成FAPα活化的前體藥物Z-GP-DAVLBH，數(shù)據(jù)表明Z-gp-DAVLBH能選擇性誘導FAPα+HSCs細胞凋亡，擾亂血管選定，克服血管選定介導的貝伐單抗單抗治療耐藥。
總結(jié)
本文通過運用轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學技術進行前期數(shù)據(jù)探索性挖掘，并結(jié)合細胞和分子生物學技術揭示了貝伐單抗耐藥的腫瘤細胞高表達FGFBP1 ，并通過FGFBP1-FGF2-FGFR1-ERK1/2-EGR1通路誘導HSCs中FAPα蛋白的表達，F(xiàn)APα進而促進HSCs中CXCL5的分泌后激活CXCR2來增強MDSC的浸潤和腫瘤細胞EMT，最終促進血管選定。此外，用FAPα激活的前藥物Z-GP-DAVLBH靶向FAPα+HSCs有效地克服了血管選定介導的CRCLM對抗血管生成治療的耐藥性，提供了潛在的治療策略和藥物候選。
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