流式細胞術在CAR-T臨床研發(fā)前的應用
嵌合抗原受體T細胞免疫療法(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，CAR-T)，是通過基因工程技術將自體或異體T細胞改造成針對腫瘤特異性抗原的新型殺傷細胞，該療法已經(jīng)在血液腫瘤的治療上取得了矚目的成效。CAR-T細胞免疫療法的臨床前研究，是成藥中關鍵且漫長的一步，包括了靶點發(fā)現(xiàn)、抗體的開發(fā)、scFv篩選、CAR-T細胞的構建、CAR-T細胞體外抗腫瘤活性和CAR-T細胞體內抗腫瘤活性評估等多個重要環(huán)節(jié)。
流式細胞術是一種可對懸浮于流體中的微小顆粒進行計數(shù)和分選的技術，由于其高效、簡便、準確等特點，已經(jīng)廣泛應用于CAR-T細胞治療的各個環(huán)節(jié)。下面帶大家了解流式細胞術在CAR-T臨床研發(fā)前的應用。
一、檢測靶點抗原的表達豐度
CAR-T細胞通過其scFv精準識別腫瘤細胞上的抗原并發(fā)揮殺傷作用，因此篩選理想的靶點抗原是一個重要的步驟。篩選高特異性的靶點抗原，需要檢測靶點抗原在所有細胞中的表達豐度，篩選到在腫瘤細胞高表達且在正常細胞不表達或低表達的抗原，以此盡可能避免CAR-T細胞療法的毒副作用。流式細胞術在這個過程中有重要的應用。比如下面的報道中，作者通過流式細胞術檢測了靶點抗原BCMA的分布情況，發(fā)現(xiàn)BCMA在正常和腫瘤PC細胞上均高表達。而在正常組織中不表達或低表達。
圖1 流式細胞術檢測靶點抗原的表達豐度[1]
二、病毒滴度檢測
CAR-T臨床研發(fā)前需要構建CAR-T細胞和抗原過表達的腫瘤細胞模型，用于后續(xù)評估CAR-T細胞的抗腫瘤能力。一般而言，通過能夠編碼目的序列的慢病毒來侵染對應的細胞系，可高效構建上述的穩(wěn)轉細胞模型。在這個過程中，慢病毒的滴度是受到嚴格質控的。流式細胞術是其中一種檢測慢病毒活性滴度的重要手段。下面以一個實例介紹流式細胞術在慢病毒滴度檢測方面的應用：
我們需要檢測CD19抗原慢病毒的滴度，將能編碼CD19抗原的慢病毒純化液以0.01、0.1、1、10μl四個梯度分別加入到事先接種的293T細胞中，72小時后流式檢測293T細胞CD19抗原的陽性率（即被慢病毒感染的293T細胞占細胞總數(shù)的百分比），進而按如下公式計算慢病毒的轉導滴度：
A：表示0.1μl組陽性細胞占比
B：表示0.01μl組陽性細胞占比
N：加入病毒時候細胞數(shù)量
V：表示A組中病毒的加入體積
圖2 CD19抗原慢病毒滴度檢測結果
（數(shù)據(jù)來源：賽業(yè)生物）
如圖所示，CD19抗原陽性細胞的數(shù)量隨轉染病毒梯度的增加而逐漸升高，表明該慢病毒有良好的感染活性，并按上述公式計算病毒滴度為：1.4×108Tu/ml。
同樣地，采用上述方法檢測CD19 CAR慢病毒滴度，經(jīng)計算后得到病毒滴度約為：4.33×108Tu/ml。
圖3 FMC63 CAR慢病毒滴度檢測結果
（數(shù)據(jù)來源：賽業(yè)生物）
三、CAR-T細胞表型分析以及CAR陽性率（或過表達抗原細胞模型的抗原陽性率）
對于構建好的CAR-T細胞，在進行功能驗證前需要檢測其表型和CAR分子的陽性率。流式細胞術可有效檢測CAR-T細胞表面的標志蛋白和CAR分子的陽性率。同理，對于構建的過表達抗原細胞模型，也可通過流式細胞術檢測抗原表達情況。下面通過實例進行介紹。
▶ 檢測T細胞的表型及CD19 CAR-T細胞陽性率陽性率
對兩種方法制備T細胞用抗體標記后表型進行分析，結果顯示兩種方法均能獲得高純度的T細胞，但二者擴增出來的不同亞型T細胞的占比有較大的差異，Method1擴增出來的T細胞以CD8+T細胞亞型為主，而Method2可擴增出CD8+T細胞和CD4+T細胞占比差異較小的T細胞群體，這兩種方法為研究不同亞型T細胞的作用奠定了堅實的基礎。同時，我們用CD19 CAR慢病毒轉染Method1擴增出來的T細胞，構建CD19 CAR-T細胞，并使用流式法檢測CAR蛋白的表達效率，結果顯示CD19 CAR-T的陽性率可達到45.59%，表明我們成功構建了CD19 CAR-T細胞。
圖4 T細胞表型分析及FMC63 CAR-T細胞陽性率檢測。A.PBMC活化擴增第十天T細胞占比及表型分析實驗結果。B.FMC63 CAR-T細胞CAR陽性率檢測結果。（數(shù)據(jù)來源：賽業(yè)生物）
▶ 質控CD19-293T細胞株構建
通過CD19慢病毒感染293T細胞，構建CD19穩(wěn)定表達的293T細胞株，并采用流式檢測其抗原CD19的高表達。
四、體外檢測CD19 CAR-T細胞的殺傷效果
將CAR-T細胞與腫瘤細胞或構建的抗原過表達細胞模型混合，檢測腫瘤細胞或抗原過表達細胞模型的死亡，可反映CAR-T細胞殺傷效果。其中，通過流式細胞術可檢測腫瘤細胞的凋亡情況。如下面的這個實例：
將CD19 CAR-T細胞和T細胞分別以不同效靶比同Nalm6細胞共孵育48h，隨后流式法檢測腫瘤細胞凋亡。如圖所示，與T細胞組相比，不同效靶比條件下，CD19 CAR-T細胞均展現(xiàn)出了對Nalm6細胞明顯增強的特異性細胞毒性作用。同時細胞培養(yǎng)上清中細胞因子含量檢測結果也顯示，同腫瘤細胞共孵育后CD19 CAR-T細胞因子IFN-γ分泌量相比于T細胞具有顯著的增強。
五、監(jiān)控體內CAR-T細胞的治療效果
在體外驗證CAR-T細胞的表型與殺傷效果后，就可以進行體內實驗。將CAR-T細胞注射到腫瘤小鼠模型（比如：NSG，C-NKG，NOG等），接著取不同天數(shù)的外周血樣（Peripheral blood, PB），使用流式細胞術分析，便可以監(jiān)測CAR-T細胞在體內的增殖活性、細胞表型和殺傷能力。
六、總結
CAR-T療法是腫瘤治療領域最具前景的方向之一，是一種“治愈”癌癥的治療方法。其臨床前研究需要經(jīng)歷多個重要的環(huán)節(jié)，而每個環(huán)節(jié)都需要嚴格的質控標準。近年來，隨著流式細胞術的不斷發(fā)展，并且基于其自身的優(yōu)勢特點，必將更廣泛的應用于CAR-T細胞治療產(chǎn)品開發(fā)的各個環(huán)節(jié)。
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參考文獻：
Bu DX, Singh R, Choi EE, et al. Pre-clinical validation of B cell maturation antigen (BCMA) as a target for T cell immunotherapy of multiple myeloma. Oncotarget. 2018;9(40):25764-25780.
