單細胞測序助力藥物治療研究發(fā)表高分文章-小鼠糖尿病腎病的治療

糖尿病腎病(DKD)發(fā)生在~40%的糖尿病患者中，并會導致腎衰竭和心血管疾病。研究者使用單細胞核轉(zhuǎn)錄組測序(snRNA-seq)分析了小鼠DKD模型的五種治療方案。百萬級別的細胞圖譜顯示，所有腎細胞類型對DKD及其治療均有異質(zhì)反應。單一療法和聯(lián)合療法針對不同的細胞類型，并誘導了明顯的轉(zhuǎn)錄變化。鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白2抑制劑(SGLT2i)在近端小管S1段的早期影響表明，這類藥物可以誘導禁食模擬和缺氧反應。糖尿病腎病模型中近端小管中剪接體調(diào)節(jié)蛋白絲氨酸/精氨酸豐富剪接因子7 (Srsf7)下調(diào)，該因子又可被SGLT2i特異性回復。在體外，近端小管敲除Srsf7誘導了一種促炎癥表型，這意味著可變剪接是DKD的驅(qū)動因素，表明了SGLT2i調(diào)控近端小管的可變剪接是這類藥物的潛在作用機制。

 

文章題目：Mapping the single-cell transcriptomic response of murine diabetic kidney disease to therapies

中文題目：關于小鼠糖尿病腎病治療的單細胞轉(zhuǎn)錄組圖譜

見刊時間：2022.07

期刊名稱：Cell Metabolism

影響因子：31.373

實驗平臺：10x Chromium單細胞核轉(zhuǎn)錄組測序

DOI：10.1016/j.cmet.2022.05.010

 

研究內(nèi)容

• 小鼠腎臟中的細胞異質(zhì)性

研究者首先構建了小鼠的糖尿病腎病模型，并且通過檢測尿白蛋白/肌酐比(UACR)、收縮壓(SBP)和葡萄糖來檢測模型構建質(zhì)量。實驗共分為7組：db/m (control)、db/db (vehicle)、db/db + ACEi、db/db + Rosi、db/db + SGLT2i、db/db + ACEi + Rosi和db/db +ACEi + SGLT2i。糖尿病腎病小鼠進行相應方式給藥后，研究者對UACR, SBP和葡萄糖再次進行檢測評價出聯(lián)合治療方式比單一治療方式更佳（如圖1）。隨后研究者對小鼠腎臟組織用10xChromium平臺進行了單細胞核測序并得到了一共946,660個高質(zhì)量的單細胞，這些單細胞被分成了18個細胞群。研究者觀察到內(nèi)皮細胞、免疫細胞、TAL細胞和成纖維細胞之間存在顯著的異質(zhì)性。研究者還分別對這四種細胞的亞型進行了鑒定（如圖2）。

圖1實驗計劃，組織學和生理學數(shù)據(jù)

圖2 DKD小鼠模型藥物治療的單細胞圖譜

 

• DKD進展過程中基因的差異表達

研究者為了評估DKD進展過程中的基因表達變化，比較了對照組(db/m)、db/db組和db/db + reninAAV組小鼠在2天和2周的snRNA-seq譜。差異表達基因數(shù)量最多的細胞類型包括主細胞(PC)、TAL、頂葉上皮細胞(PECs)、PT和內(nèi)皮細胞(ECs)。超過一半的差異表達基因僅在單細胞類型中檢測到，這顯示出糖尿病模型中腎細胞的異質(zhì)性。隨后研究者分析了在這兩個時間點異質(zhì)性最強的兩種細胞群中上調(diào)和下調(diào)的基因。這項分析確定了許多可能作為疾病生物標志物的基因。已知DKD中某些特定腎細胞類型存在差異表達基因，研究者接下來用GWAS識別出慢性腎臟疾病(CKD)相關常見變異是否也與特定的腎臟細胞類型有關。隨后利用MAGMA將GWAS估算的腎小球濾過率(eGFR)、蛋白尿和血尿素氮(BUN)與疾病進程中每種細胞類型聯(lián)系起來。分析結果顯示，內(nèi)皮細胞和收集管細胞(PC和遠曲小管[DCT])與eGFR顯著相關。PC與CKD顯著相關。而PC和EC也為DKD中差異表達基因(DEGs)數(shù)量最多的前三種細胞類型（如圖3）。

圖3 DKD進展過程中的基因表達變化

 

• DKD治療的細胞異質(zhì)性

接下來，研究者研究了不同的治療方案在多大程度上可以回復每種細胞類型中由DKD誘導的基因表達變化。研究結果表明：某些細胞類型的轉(zhuǎn)錄變化發(fā)生在早期，而有些細胞類型則恰恰相反。因此不同治療方案對細胞類型和時間存在特異性影響。例如，與第14天相比，第2天足細胞、DCT和連接小管(CNT)中的疾病基因被回復的比例更高，而與第2天相比，14天的治療回復了更多的TAL和DTL中的疾病基因。然而，在PEC、TAL、PC和ICA中，通過Rosi治療的靶基因和通路是非常不同的，但它們都通過治療得到了改善。隨后研究者對疾病及其治療過程中細胞間通訊模式及其變化進行了分析。分析結果顯示：細胞通訊變化最顯著的細胞類型包括足細胞、PT、DTL和TAL。研究者研究了每種治療方案如何使足細胞、PT和TAL的信號評分標準化：SGLT2i的單獨治療的情況下，PT細胞的評分最好。本分析特異性鑒定了受損PT信號通路與足細胞和成纖維細胞共同分泌的骨橋蛋白(Spp1)。Spp1已被證明通過調(diào)節(jié)DKD模型中的足細胞信號通路在蛋白尿中發(fā)揮重要作用。ACEi + Rosi或ACEi + SGLT2i聯(lián)合治療能最好地抑制骨橋蛋白細胞間信號，這與損傷標志物Havcr1的表達降低相關，進一步強調(diào)了聯(lián)合治療效果更佳（如圖4）。

圖4 根據(jù)損傷的細胞類型和損傷后的細胞與其他細胞之間的通訊，將差異表達的基因經(jīng)處理歸一化

 

• 聯(lián)合用藥治療PT細胞的損傷

研究者經(jīng)綜合分析確定了一組用于研究的損傷狀態(tài)的近端小管細胞(注釋為“inji .PT”)，其表達典型的標志物：Havcr1、Vcam1和C3。聯(lián)合用藥可顯著降低DKD中PT損傷標志物Havcr1的異常上調(diào)，并且比單一用藥效果好。對小鼠樣本進行Bulk RNA-seq，并證實聯(lián)合治療在降低損傷PT細胞比例方面最有效。研究者進一步比較了聯(lián)合治療組與單一治療組糖尿病腎損傷PT的基因表達變化。該分析顯示，單一藥物治療后損傷評分沒有顯著變化，但聯(lián)合治療2周后損傷評分顯著下降。作為補充分析，研究者應用了另一種算法(scID)分析后顯示：兩種藥物聯(lián)合治療后，損傷的PT細胞可以更大比例映射到健康的腎臟細胞(如圖5)。

圖5 聯(lián)合治療改善近端小管損傷更有效

 

• 藥物治療對腎小球的反應

研究者首先確定了腎小球亞細胞類型：足細胞（Pod）、系膜細胞(MCs)、GECs和PEC。隨后對這四種細胞中的marker基因進行了展示。研究者參考前人研究數(shù)據(jù)并依據(jù)相應細胞類型整理了人類和小鼠DKD共同差異基因表達的列表，從而評估了不同治療方案對DKD相關基因表達的影響，并再次揭示了異質(zhì)性。接下來，研究者對介導GEC到足細胞的信號轉(zhuǎn)導的配體受體對進行了研究。結果表明，內(nèi)皮細胞來源的Bmp6-（Bmpr1b+Bmpr2）信號通路可被糖尿病強烈誘導，而這一信號通路在SGLT2i單獨或聯(lián)合治療時明顯減弱。與Bmp6-（Bmpr1b+Bmpr2）不同，Bmp6-（Bmpr1a+Bmpr2）在GECs中有糖尿病會特異性上調(diào)，其受體Bmpr1a在足細胞中高表達（如圖6）。

圖6 糖尿病腎小球通訊網(wǎng)絡及其治療

 

• 通過比較SGLT2i對PTS1和PTS2的影響，推斷SGLT2i的機制

SGLT2i靶向鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運蛋白Slc5a2，該蛋白專一表達于PT S1段的頂膜上。研究者對此進行了證實。隨后他們對單一治療和聯(lián)合治療在2周時如何改變S1和S2片段的基因表達進行了分析。證明S1段確為SGLT2抑制的直接靶點。接下來，他們對S1和S2的所有EDG進行GO分析。結果表明，SGLT2i直接誘導S1段的饑餓模擬和缺氧反應。研究者又對S1和S2數(shù)據(jù)集中EDG進行了分析得出結論：顯著上調(diào)的因子Srsf7可能參與其中。Srsf7可編碼調(diào)節(jié)mRNA剪接的絲氨酸/精氨酸(SR)剪接體蛋白。有研究表明，Srsf7在小鼠中可以通過調(diào)節(jié)促進合成代謝和抑制衰老途徑的基因的可變剪接來促進幼年轉(zhuǎn)錄組基因程序。因此，SGLT2i的一種作用機制可能是調(diào)節(jié)可變剪接來激活保護性的代謝（補充圖，此處未列出）。

研究者證實，只有SGLT2i可回復S1段的Srsf7表達。他們建立體外細胞培養(yǎng)模型[人原代腎PT細胞(RPTEC)]發(fā)現(xiàn)：在RPTEC中通過小干擾RNA (siRNA)敲除Srsf7，mRNA和蛋白敲降效率均>80%。對其進行Bulk RNA-seq顯示了基因表達的巨大差異。對這些基因變化的通路分析顯示，Srsf7基因敲除后，多種促炎因子表達上調(diào)，表明Srsf7基因通常在S1段促進健康和抗炎表型。進一步分析顯示：許多被SGLT2i回復的基因在Srsf7敲除后也存在差異表達，這提示了我們的體外模型和體內(nèi)結果之間有一定的機制聯(lián)系（如圖7）。

圖7 SGLT2i對S1段和S2段的影響

 

主要結論

研究者構建了糖尿病腎病小鼠模型并進行不同方式給藥處理（共五種），在兩個時間點（治療2天和2周）使用單細胞核測序了百萬級別的細胞并進行了相應的分析，分析結果體現(xiàn)了細胞之間的異質(zhì)性，并且聯(lián)合治療要比單一治療效果更好。研究者的DKD單細胞圖譜及其治療方法將有助于詳細探索疾病進展的機制，并更深入地了解目前的治療方法如何減緩DKD的進展。

 

參考文獻：

Wu H, Villalobos RG, Yao X, Reilly D, Chen T, Rankin M, Myshkin E, Breyer MD, Humphreys BD. Mapping the single-cell transcriptomic response of murine diabetic kidney disease to therapies. Cell Metab. 2022 Jul 5;34(7):1064-1078.e6. doi: 10.1016/j.cmet.2022.05.010. Epub 2022 Jun 15. PMID: 35709763; PMCID: PMC9262852.