分批補料微型生物反應(yīng)器設(shè)計的最新進展

目錄

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01/介紹

02/內(nèi)部補料策略

    1.擴散控制補料

    2.酶控補料

    3.內(nèi)部補料策略小結(jié)

03/外部補料策略

    1.自動化液體處理系統(tǒng)

    2.用于分批補料微生物反應(yīng)器系統(tǒng)的微流體和微型閥技術(shù)

    3.外部補料策略小結(jié)

04/結(jié)論

 

前言

先進的分批補料微生物反應(yīng)器可降低擴大規(guī)模的風(fēng)險，并更接近模擬工業(yè)培養(yǎng)實踐。近年來，已經(jīng)開發(fā)了高通量微量補料策略，無論實驗預(yù)算如何，都可以提高微量分批補料培養(yǎng)的可及性。該綜述探討了這些技術(shù)及其在加速生物過程開發(fā)中的作用。擴散和酶控制的補料可實現(xiàn)基質(zhì)的連續(xù)供應(yīng)，且簡單實惠。更復(fù)雜的補料曲線和更強的過程控制需要額外的硬件。自動液體處理機器人可被編程為預(yù)定義的補料曲線，并具有響應(yīng)過程參數(shù)偏差的靈敏度。
 

研究顯示，微流體技術(shù)可促進連續(xù)和精確補料。將自動化高通量分批補料培養(yǎng)與實驗設(shè)計和基于模型的優(yōu)化相結(jié)合的整體方法極大地增強了過程理解，同時最大限度地減少了實驗負擔(dān)。為在線優(yōu)化補料條件引入實時數(shù)據(jù)可進一步細化篩選。盡管該綜述中討論的技術(shù)有望實現(xiàn)高效、低風(fēng)險的生物過程開發(fā)，但自動化培養(yǎng)平臺的費用和復(fù)雜性限制了其廣泛應(yīng)用。未來的關(guān)注點應(yīng)該集中在開源軟件的開發(fā)上，減少硬件的排他性。
 

01介紹

許多公司依賴于不可再生的石化原料以及更復(fù)雜工藝的天然產(chǎn)品所需的大量步驟可能會阻礙經(jīng)濟可行性，將可再生原料生物轉(zhuǎn)化為此類天然產(chǎn)物的微生物細胞工廠的建設(shè)，引起了人們的極大興趣。

生物工藝開發(fā)的初始階段涉及廣泛篩選各種菌株和工藝參數(shù)。使用簡單的批量微量滴定板(MTP)或搖瓶培養(yǎng)在此階段仍然很普遍，這主要是由于與實驗室規(guī)模的攪拌反應(yīng)器相比，它們的成本相對較低且通量較高。然而，由于體積小和缺乏用于在線監(jiān)測和控制基礎(chǔ)設(shè)施，分析通常限于端點分析，限制了過程洞察力。

在這種情況下，先進的 微型生物反應(yīng)器MBR 系統(tǒng)越來越多地被采用，其目的是克服這些關(guān)鍵的瓶頸。使用新的混合策略，盡管空間和資源要求顯著降低，但仍有可能有效模擬較大的實驗室生物反應(yīng)器。許多裝置可以并行運行，便于高通量篩選應(yīng)用。通過將 MBR 技術(shù)與戰(zhàn)實驗設(shè)計(DoE)方法相結(jié)合，可以進一步最大化過程洞察力，同時最小化實驗負擔(dān)。DoE 促進了對生物系統(tǒng)中無處不在的因素相互作用的系統(tǒng)評估，以及對設(shè)計空間的更廣泛探索。為確保工業(yè)規(guī)模的最佳性能，應(yīng)在生物過程開發(fā)的早期階段應(yīng)用 DoE 同時優(yōu)化遺傳和環(huán)境。

微規(guī)模培養(yǎng)和工業(yè)規(guī)模培養(yǎng)之間的培養(yǎng)策略的主要不一致性可導(dǎo)致在生物過程開發(fā)的最早階段選擇次優(yōu)菌株和過程條件。因此，必須將過程控制策略和分批補料操作納入高通量篩選，以確保更接近地模擬工業(yè)規(guī)模的培養(yǎng)條件。

最近開發(fā)了幾種具有內(nèi)置補料、控制和采樣能力的新型 MBR，以克服這一關(guān)鍵瓶頸。已經(jīng)研究了創(chuàng)新的內(nèi)部和外部補料策略及其模仿不同常用工業(yè)補料策略的潛力，例如脈沖、指數(shù)、修正指數(shù)和線性補料。內(nèi)部分批補料策略包括擴散和酶控制的補料，通常涉及由半透膜分開的雙相培養(yǎng)基和多糖基質(zhì)的生物催化分解。通過使用微流體和自動化液體處理系統(tǒng)(LHSs)。這種系統(tǒng)提供了改進的補料控制，允許更有效地模仿工業(yè)相關(guān)的脈沖、線性和指數(shù)進給策略。引入基于模型的優(yōu)化算法以實時分析過程數(shù)據(jù)并重新確定最佳培養(yǎng)策略也獲得了極大的興趣， 以進一步加快生物過程開發(fā)。

將新型分批補料 MBR 與統(tǒng)計 DoE 和基于模型的優(yōu)化策略相結(jié)合的整體方法可能是穩(wěn)健菌株開發(fā)和優(yōu)化的最佳方法。通過對大量遺傳和環(huán)境因素組合進行戰(zhàn)略性高通量篩選，可以確保設(shè)計質(zhì)量，同時監(jiān)測和控制工業(yè)相關(guān)工藝參數(shù)。與傳統(tǒng)方法相比，這種增加的過程洞察力有可能通過減少所需的篩選階段的數(shù)量來大大加快生物過程的開發(fā)。

02 內(nèi)部補料策略

在內(nèi)部分批補料系統(tǒng)中，基質(zhì)在培養(yǎng)容器內(nèi)逐漸釋放，無需外部補料。這些系統(tǒng)的主要特點是它們與現(xiàn)有基礎(chǔ)設(shè)施的兼容性。由于不需要先進的微型泵、微流體或液體處理機器人技術(shù)，因此可以顯著降低成本和復(fù)雜性。這種系統(tǒng)通常利用擴散或催化現(xiàn)象。

2.1擴散控制補料

擴散控制進料涉及將截留的營養(yǎng)物從聚合物吸附劑或通過人工膜緩慢釋放。培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)擴散穿過半透性透析膜，然后被細胞利用。Philip 等人 2017年闡明了作為影響補料速率的關(guān)鍵因素的兩個參數(shù)，儲器中的初始基質(zhì)濃度和膜幾何形狀。這有助于更好的補料速率控制，并且發(fā)現(xiàn)盡管培養(yǎng)體積放大了 100 倍。然而，使用透析膜的擴散控制補料方法的一個主要限制是其對搖瓶培養(yǎng)的限制， 這限制了生產(chǎn)量。
 

Jeude等人2006 年開發(fā)了 FeedBead®技術(shù)，這項技術(shù)最初也是為了在搖瓶中使用而開發(fā)的，但 Scheidle 等人 2009 年證明了 FeedBead®技術(shù)適用于 MTP 應(yīng)用。Keil 等人于 2019 年開發(fā)了一種 MTP FeedPlate®系統(tǒng)，該系統(tǒng)在每個孔的底部包含一個固定的固體有機硅基質(zhì)和嵌入的葡萄糖晶體。在這些 FeedPlates®中，GFP 產(chǎn)量提高了 245 倍。該板以 24、48 或 96 孔形式上市，允許以分批補料模式直接進行高通量培養(yǎng)。然而，培養(yǎng)基 pH、溫度和滲透壓等外部因素對葡萄糖釋放速率有主要影響。因此，使用該技術(shù)時，對基質(zhì)釋放速率的精確控制受到限制。
 

2016 年，F(xiàn)litsch 等人研發(fā)了一種改進的 μ-RAMOS 設(shè)備，其目的是克服原始設(shè)備的瓶頸。更新后的系統(tǒng)在 48 孔 MTP 的每個孔中配備了氣體入口和出口閥以及光學(xué)傳感器，便于對所有 48 種培養(yǎng)物同時進行 OTR 監(jiān)測。該技術(shù)最近被進一步擴展用于 96 孔深孔 MTP，使研究人員能夠?qū)崿F(xiàn)比原始搖瓶規(guī)模的RAMOS 系統(tǒng)增加 15 倍的實驗通量。Habicher 等人 2020 年證明了最先進的 μ- RAMOS 和 FeedPlate®對于工程化用于蛋白酶生產(chǎn)的地衣芽孢桿菌菌株的葡萄糖限制培養(yǎng)的兼容性。OTR 的在線監(jiān)測極大地改善了 MTP 培養(yǎng)物的信息含量，發(fā)現(xiàn)其在 MTP 和搖瓶規(guī)模下的性能相當。使用該平臺生成的數(shù)據(jù)可用于在開發(fā)的最早階段生成數(shù)學(xué)模型，從而根據(jù)設(shè)計原則顯著改善了過程質(zhì)量。
 

Wilming 等人 2014 年使用 96 孔 MTP 開發(fā)了一種替代的基于擴散的分批補料系統(tǒng)。每個培養(yǎng)孔通過填充有聚丙烯酰胺水凝膠的擴散通道連接至儲層孔，便于每個平板進行多達 44 次平行分批補料培養(yǎng)。用濃縮基質(zhì)溶液填充儲器，以實現(xiàn)逐步擴散驅(qū)動補料。通過改變儲器中的濃度并由此改變驅(qū)動濃度梯度。然而， 發(fā)現(xiàn)補料濃度和葡萄糖釋放速率之間的關(guān)系是非線性的。這種使補料速率微調(diào)復(fù)雜化的非線性歸因于水的反向擴散。盡管如此，板的透明底座提供了與板讀取技術(shù)兼容的主要優(yōu)勢，例如用于通過散射光測量生物量和熒光的 BioLector 系統(tǒng)(mp2-Labs，德國)。使用該系統(tǒng)證明了大腸桿菌和多形嗜血桿菌菌株的分批補料培養(yǎng)。與分批對照相比，用最佳 300g/L 葡萄糖補料進行大腸桿菌的分批補料培養(yǎng)分別導(dǎo)致生物量和基于黃素單核苷酸的熒光報告蛋白信號增加約5 倍和14 倍。
 

2.2酶控補料

淀粉在液體培養(yǎng)基中的溶解度差，需要在原始 EnBase®工藝中使用固相。為了消除對雙相系統(tǒng)的需求，開發(fā)了具有完全可溶性聚合物基材的 EnBase® Flo。葡萄糖釋放方法與礦物鹽和復(fù)雜培養(yǎng)基添加劑的精心優(yōu)化組合相結(jié)合，以產(chǎn)生高細胞密度和產(chǎn)品滴度。Glazyrina 等人 2012 年通過在 3mL 至 60L 的范圍內(nèi)培養(yǎng)經(jīng)工程改造過量生產(chǎn)模型酶醇脫氫酶的大腸桿菌菌株，研究了 EnBase® Flo 系統(tǒng)的可擴展性。在所有測試規(guī)模下均實現(xiàn)了相當?shù)脑鲩L率和蛋白質(zhì)滴度，突出了可擴展性。在所有測試規(guī)模上都實現(xiàn)了可比的生長速率和蛋白質(zhì)滴度，突出了可擴展性。EnBase®系統(tǒng)還提供了在大型生物反應(yīng)器的初始培養(yǎng)階段控制葡萄糖釋放的額外好處，完全消除了溢出代謝。
 

EnBase®技術(shù)還以方便的片劑形式在市場上銷售。該 EnPresso®系統(tǒng)與 D- optimal DoE 方法相結(jié)合，可優(yōu)化 24 孔板中工程大腸桿菌的纈諾霉素生產(chǎn)。與原始分批培養(yǎng)相比，DoE 驅(qū)動的平行分批補料培養(yǎng)策略使纈氨霉素滴度提高了 33 倍。
 

2.3內(nèi)部補料策略小結(jié)

擴散和酶控制的補料策略提供了一種相對簡單和低成本的方法來模擬更大規(guī)模的分批補料過程。它們提供了恒定基質(zhì)補料的關(guān)鍵優(yōu)勢，但在整個培養(yǎng)過程中通常不可能精確控制補料速率。結(jié)果，更復(fù)雜(例如指數(shù))的進給曲線不能使用內(nèi)部補料策略。此外，補料通常限于單一基質(zhì)，這可能導(dǎo)致培養(yǎng)基中的其他營養(yǎng)物變得有限。特別是基于酶的補料依賴葡萄糖作為碳源，這可能不是所有過程的最佳選擇。此外，在此類系統(tǒng)中，酸和堿補料通常是不可能的，從而限制了過程控制能力。

 

03 外部分批補料策略

在外部分批補料系統(tǒng)中，基質(zhì)從外部儲器補料。該策略的主要優(yōu)點是增加了靈活性和過程控制能力。然而，由于補料需要額外的基礎(chǔ)設(shè)施，外部分批補料系統(tǒng)固有地更復(fù)雜且操作成本更高。
 

3.1自動化液體處理系統(tǒng)

使用液體處理工作站可以實現(xiàn)高通量采樣以及向 MTP 或平行 MBR 中添加液體。例如，RoboLector®包括集成的 BioLector®（mp2-Labs，德國）MBR 篩選平臺。自動取樣編程為每 24 小時一次。補料和取樣均在不中斷搖動的情況下實現(xiàn)，從而最大限度地減少對氧氣傳輸?shù)母蓴_并防止細胞沉降，從而允許獲得代表性的樣品。

與脈沖補料策略相關(guān)的關(guān)鍵挑戰(zhàn)是缺乏連續(xù)的補料供應(yīng)，這導(dǎo)致細胞代謝中的振蕩并限制與工業(yè)規(guī)模發(fā)酵的可比性，在工業(yè)規(guī)模發(fā)酵中，指數(shù)補料策略更常用。Jansen 等人于 2019 年開發(fā)了一種自動反饋調(diào)節(jié)的基于酶的分批補料系統(tǒng)(FeedER)。可以通過控制添加來實現(xiàn)定義的指數(shù)生長速率。
 

Ambr®平臺通過添加泵送液體管線，可以向每個單獨的反應(yīng)器中連續(xù)添加液體�？朔�了間歇補料的局限性，有利于實施連續(xù)補料方案和更嚴格的 pH 控制。
 

Bioreactor48 平臺（2mag，德國）與Freedom EVO(TECAN，瑞士) LHS 相結(jié)合，以實現(xiàn)分批補料和過程控制。Bioreactor通過 LHS 向含有 β-呋喃果糖苷酶的培養(yǎng)物間歇投加蔗糖，使可代謝的果糖和葡萄糖得以連續(xù)釋放。對間歇葡萄糖和酶促攝食策略的比較表明，生物量累積非常相似，但是，連續(xù)(酶促)攝食增強了 GFP 熒光。DO 振蕩在間歇補料培養(yǎng)物中顯著更大。
 

3.2 用于分批補料微生物反應(yīng)器系統(tǒng)的微流體和微型閥技術(shù)

與自動 LHS相關(guān)的一個關(guān)鍵挑戰(zhàn)是補料的間歇性。近來，微流體技術(shù)已經(jīng)被實施，其目的在于開發(fā)更精確的工業(yè)過程的按比例縮小模型。微流控生物反應(yīng)器系統(tǒng)涉及對小體積流體的受控操作。

在 Mardanpour 和 Yaghmae 研究中，使用大腸桿菌作為生物催化劑，在微流控微生物燃料電池(MFC)中以分批補料模式從葡萄糖和尿素產(chǎn)生生物電。為了構(gòu)建微流控 MFC，使用具有單個微通道的聚甲基丙烯酸甲酯板作為主體，使用鎳基陽極和負載鉑的碳覆蓋陰極作為主體頂部和底部的電極，通過這種方式，親水性鎳表面吸收陽極電解液并促進細胞附著，從而促進生物膜的生長。

為了確定最適合再現(xiàn)大型生物反應(yīng)器波動條件的微流體系統(tǒng)，Ho 等人比較了三種廣泛使用的微流體設(shè)計。該研究表明，微流體系統(tǒng)的設(shè)備設(shè)計在定量和靈敏地再現(xiàn)典型工業(yè)規(guī)模生物反應(yīng)器中的不均勻性方面起著關(guān) 鍵作用，可能會影響分批補料系統(tǒng)的工藝產(chǎn)率。
 

微流控FlowerPlate 技術(shù)最近被用于優(yōu)化谷氨酸棒桿菌的綠色熒光蛋白(GFP) 生產(chǎn)。Morschett 等人開發(fā)了一種高通量、并行化的 pH 控制分批補料培養(yǎng)工作流程，可在線監(jiān)測微孔板中的生物量、pH 值、DO 和熒光。每排的兩個容器中分別加入葡萄糖-尿素補料溶液和 3M 磷酸(單側(cè) pH 控制)。將具有不同補料策略(脈沖、恒定、指數(shù))的分批補料工藝與標準分批工藝進行了比較。

商業(yè)微基質(zhì)(Applikon Biotechnology，荷蘭)平臺是一種接近連續(xù)補料的替代方法，這種方法便于通過微型閥對每種單獨的 μBR 進行獨立的液體添加。該最先進系統(tǒng)基于標準 24 孔深孔板，工作體積為 2–7mL，具有集成的熒光團 pH 和溶解氧傳感器，以及每個單獨孔的獨立氣體和液體添加量。

3.3 外部補料策略總結(jié)

具有自動外部補料和嚴格控制工藝參數(shù)的新型 MBR 技術(shù)的最新進展，使得能夠更接近地模擬工業(yè)規(guī)模的生物過程。通過自動化，實驗的吞吐量和精確度得到了顯著的提高。機器人 LHS 已證明了在微尺度下有效高通量分批補料培養(yǎng)的潛力。它們可以與現(xiàn)有硬件相結(jié)合，并易于編程，以實現(xiàn)廣泛的實驗應(yīng)用。通過安裝液體處理機器人和分析設(shè)備，對 Bioreactor 培養(yǎng)平臺進行了改造，實現(xiàn)了全自動受控分批補料培養(yǎng)，并具有自動取樣和在線樣本分析功能。Mühlmann 等人的一項研究也證明了 RoboLector®平臺的適應(yīng)性，為了實現(xiàn)自動補料培養(yǎng)基制備和細胞培養(yǎng)，安裝了額外的冷卻器、加熱器搖動器和真空站。移液操作可以預(yù)先編程以執(zhí)行定義的補料配置文件并以高精度重復(fù)多次。LHS 補料的另一個限制是它的間歇性。微流體設(shè)備提供連續(xù)的補料供應(yīng)，以更接近地代表工業(yè)規(guī)模條件�？梢允褂梦⒘黧w裝置分配小體積，使得它們對單個細胞的研究特別有吸引力。由于對分離細胞的研究允許將細胞內(nèi)效應(yīng)與細胞間或群體效應(yīng)區(qū)分開來，因此這可能有利于菌株的發(fā)育。
 

具有外部補料和無創(chuàng)在線監(jiān)測的自動化并行MBR 平臺允許在相對短的時間內(nèi)生成大量高質(zhì)量數(shù)據(jù)集。然而，由于高設(shè)備成本和廣泛的編程要求，投資比更簡單的內(nèi)部系統(tǒng)要大得多。

04 結(jié)論

在過去的十年中，微量高通量分批補料培養(yǎng)技術(shù)取得了長足的進步。已經(jīng)開發(fā)了各種復(fù)雜性和硬件要求不同的補料機制，使得流式分批培養(yǎng)越來越容易獲得。由于與傳統(tǒng)的分批培養(yǎng)系統(tǒng)相比，分批補料系統(tǒng)可以更接近地模擬工業(yè)規(guī)模條件，因此它們可以最大限度地降低與生物工藝規(guī)模相關(guān)的風(fēng)險。

盡管成本相對較低且易于實施，在整個培養(yǎng)過程中不可能進行精確的補料速率控制，并且補料通常僅限于單一基質(zhì)。通過引入外部硬件，可以實現(xiàn)更復(fù)雜的補料分布和過程參數(shù)(如 pH)控制。自動液體處理機器人可被編程為響應(yīng)于過程參數(shù)與指定設(shè)定點的偏差或根據(jù)預(yù)定義的補料曲線執(zhí)行液體添加。最近，自動化液體處理機器人的可負擔(dān)性有了顯著提高，然而，為確保其廣泛應(yīng)用，有必要開發(fā)標準化操作程序和直觀的軟件，以便于其簡單操作。盡管它們的高精度和靈活性很有優(yōu)勢，因為補料是通過間歇推注進行的，但無法實現(xiàn)工業(yè)相關(guān)的連續(xù)補料曲線。然而，這可以很容易地通過耦合 LHS 和酶控制的補料策略來解決。微流體技術(shù)也被開發(fā)出來，以便于非常小體積的連續(xù)精確補料。

通過將自動化的高通量分批補料培養(yǎng)平臺與實驗的戰(zhàn)略設(shè)計和基于模型的 優(yōu)化策略相結(jié)合，可以顯著增強對過程的理解，同時最大限度地減少實驗負擔(dān)。結(jié)合實時數(shù)據(jù)來重新確定最佳補料添加和工藝控制策略顯示出增強生物工藝開 發(fā)的巨大潛力。然而，關(guān)鍵工藝參數(shù)的在線和在線分析技術(shù)應(yīng)得到改進，以充分發(fā)揮基于模型的優(yōu)化，在大多數(shù)情況下，對優(yōu)化至關(guān)重要的底物利用率和產(chǎn)物形成等參數(shù)僅限于離線分析。對傳統(tǒng)技術(shù)（如色譜）的快速在線替代品的開發(fā)將特別有利于重新設(shè)計實驗策略。

盡管該綜述中討論的技術(shù)顯示出高效和低風(fēng)險生物工藝開發(fā)的巨大潛力，但目前自動化培養(yǎng)平臺的高成本和復(fù)雜性限制了它們的廣泛應(yīng)用。此外，這些技術(shù)和方法的標準化對于學(xué)術(shù)界和工業(yè)界的共同使用和接受至關(guān)重要，未來的工作還應(yīng)側(cè)重于開發(fā) FOSS 和 FOSH 以提高可訪問性。

 

曼森平行生物反應(yīng)器分批補料應(yīng)用

曼森采用Watson-malow 400A高精度泵頭，16 路補料，平均每個罐有四路補料，蠕動泵流量可設(shè)定，連續(xù)可調(diào)；每個蠕動泵的功能可單獨分配，可以作為酸泵、堿泵、補料泵、消泡泵、液位控制泵。

 

信息來源：

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0734975021001944?ref=pdf_download&fr=RR-2&rr=747c4db53ee4ddb1
 

文章來源：本文由中科院上海生命科學(xué)信息中心與曼森生物合作供稿

排版校對：劉娟娟編輯 

內(nèi)容審核：郝玉有博士

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