基于納米孔測序技術(shù)對人類基因組結(jié)構(gòu)變異的研究方法

人類基因組中的變異和人類的演化、疾病風(fēng)險等方面都有著密切的聯(lián)系�；�因組變異主要包括單核苷酸突變、插入缺失和結(jié)構(gòu)變異三大類。而受技術(shù)限制，結(jié)構(gòu)變異分析仍然是一大塊“神秘土地”，齊碳通過總結(jié)近幾年人類基因組結(jié)構(gòu)變異相關(guān)的研究成果，與大家分享目前基于納米孔測序技術(shù)長讀長優(yōu)勢的結(jié)構(gòu)變異測序與分析方法，為更好地從群體及個體角度解析結(jié)構(gòu)變異提供新思路。
  結(jié)構(gòu)變異（Structural variation, SV）是指序列長度大于50 bp的基因組序列變化，可以分為缺失（Deletion）、插入（Insertion）、重復(fù)（Duplication）、倒位（Inversion）和易位（Translocation）以及復(fù)雜結(jié)構(gòu)變異等。其中，缺失和重復(fù)事件也稱為拷貝數(shù)變異（Copy number variation/alteration, CNV/CNA）。  
值得一提的是，在人類基因組中，結(jié)構(gòu)變異的數(shù)量雖然遠少于單核苷酸變異（Single-nucleotide variant，SNV）的數(shù)量（表1），但研究發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)變異對基因組的影響卻更大。這是由于DNA序列變化越大，其有害性通常也越大。
 
如表1所示，人類基因組結(jié)構(gòu)變異的數(shù)量約占SNV數(shù)量的0.5%，但受結(jié)構(gòu)變異影響的堿基數(shù)卻是SNV總和的10倍之多。與SNV相比，大片段結(jié)構(gòu)變異與全基因組關(guān)聯(lián)信號相關(guān)的可能性高出3倍，影響基因表達的可能性則達30倍以上。
  隨著結(jié)構(gòu)變異成為越來越多研究關(guān)注的熱點，目前主要檢測方法呈現(xiàn)多樣化。但由于技術(shù)限制，如何更準確檢測大片段結(jié)構(gòu)變異（如拷貝數(shù)變異、大片段InDel、染色體倒位、染色體內(nèi)部或染色體之間的序列易位等）依然充滿挑戰(zhàn)。
相比于其他檢測技術(shù)，三代測序發(fā)揮長讀長的優(yōu)勢可跨越基因組中大片段結(jié)構(gòu)變異，為結(jié)構(gòu)變異的準確分析提供了新平臺。
一方面，三代測序技術(shù)有效增加了結(jié)構(gòu)變異檢測的數(shù)量和類型，例如復(fù)雜結(jié)構(gòu)變異、串聯(lián)重復(fù)和轉(zhuǎn)座元件插入等；另一方面，可以幫助獲取結(jié)構(gòu)變異更完整的信息，例如斷點位置和完整的變異序列等。    
納米孔測序檢測結(jié)構(gòu)變異的方法可分為全基因組納米孔測序和目標區(qū)域納米孔測序。 全基因組納米孔測序可以全面檢測基因組中發(fā)生的結(jié)構(gòu)變異，但通常所需數(shù)據(jù)量較大，例如能夠檢測到人類樣本約在15x測序深度下的可靠胚系結(jié)構(gòu)變異。
2020年，針對3622個冰島人樣本進行全基因組納米孔測序（深度：~17.2x）揭示了冰島人群結(jié)構(gòu)變異特征，同時還發(fā)現(xiàn)與LDL膽固醇和身高等性狀相關(guān)的基因結(jié)構(gòu)變異^[4]。
2021年，另一篇針對405個中國人樣本的全基因組納米孔測序研究（深度：~17x），將檢測到的結(jié)構(gòu)變異與其臨床性狀（生化、血液和血清成分等指標）進行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)14號染色體的22個SV事件與13個表型呈顯著相關(guān)。研究還揭示了中國南北方人在免疫相關(guān)基因上面臨著不同的選擇壓力^[5]。   目標區(qū)域納米孔測序則是僅對獲取的目標區(qū)域測序，研究針對性強且所需數(shù)據(jù)量少。獲取目標區(qū)域序列方式是多樣化的，包含PCR擴增、探針捕獲和Cas9富集。PCR擴增和探針捕獲方式獲取的目標區(qū)域測序深度較高，但在擴增過程中往往無法保留堿基的修飾信息；而Cas9富集測序的目標區(qū)域深度波動范圍較大，但可以相對完整地保留堿基修飾信息。
一項對林奇綜合征的研究，通過探針捕獲相關(guān)基因全長序列和納米孔測序（深度：~1000x），能夠檢測到MLH1和MSH2基因上的缺失或重復(fù)事件^[6]；另一項研究利用PCR對視網(wǎng)膜母細胞瘤病人RB1基因的序列擴增和納米孔測序，檢測到RB1基因exon23缺失，并在缺失位置檢測到85bp的插入序列^[7]。   由于測序數(shù)據(jù)前期可以采用比對法或組裝法處理，使得結(jié)構(gòu)變異分析方法也有所不同。
·基于比對法主要利用比對到斷點位置的Split reads識別結(jié)構(gòu)變異，即一條read被分割成多個區(qū)域比對在參考基因組不同位置。該方法常用的檢測軟件如表2所示。
 ·基于組裝法是先對個體基因組組裝，再比較組裝后的基因組和參考基因組的差異分析結(jié)構(gòu)變異。 支持數(shù)據(jù)僅為研究文章所用數(shù)據(jù)
 
相關(guān)文章基于納米孔測序數(shù)據(jù)對Snifffles、cuteSV、pbsv、NanoVar、NanoSV和SVIM等分析軟件進行測評。
 
利用數(shù)據(jù)模擬軟件得到含24600個SVs的納米孔測序數(shù)據(jù)，對已檢測出的結(jié)構(gòu)變異的位置、長度、類型和基因型信息進行軟件表現(xiàn)評估。結(jié)果顯示：測序深度超過20x后（10x、20x、30x和50x），以上軟件檢測結(jié)構(gòu)變異檢測數(shù)量的增速均有所減緩。其中，cuteSV的綜合表現(xiàn)較為穩(wěn)定。
  combiSV(6): 整合6個軟件檢測結(jié)果
perfect matches代表檢測到SV的類型、基因型、完整的長度和位置均正確
 
中國人群大規(guī)模結(jié)構(gòu)變異的研究中也發(fā)現(xiàn)，當測序深度達到15x ，若繼續(xù)增加測序深度，結(jié)構(gòu)變異檢測數(shù)量將逐漸趨于穩(wěn)定。 左：HG002在不同深度（8~40x）和軟件下檢測SV的數(shù)量；Combine代表兩個軟件交集結(jié)果
右：利用sniffles檢測3622個冰島人結(jié)構(gòu)變異的數(shù)量；每一個點代表一個個體的測序深度和檢測SV數(shù)量
 
由此可見，納米孔測序檢測結(jié)構(gòu)變異的測序方法和分析方法是多樣化的。而在實際研究應(yīng)用中，挖掘基因組結(jié)構(gòu)變異硬實力（技術(shù)平臺）和軟實力（數(shù)據(jù)算法）缺一不可，隨著檢測技術(shù)的不斷成熟和軟件算法的不斷進步，研究者可以根據(jù)自己的研究目的、數(shù)據(jù)特征和軟件檢測力選擇合適的檢測技術(shù)，或者通過不同技術(shù)組合和不同算法組合從而達到增效作用。
 
參考資料：
[1] van Belzen IAEM, Schönhuth A, Kemmeren P, Hehir-Kwa JY. Structural variant detection in cancer genomes: computational challenges and perspectives for precision oncology. NPJ Precis Oncol. 2021. 2;5(1):15.
[2] Eichler EE. Genetic Variation, Comparative Genomics, and the Diagnosis of Disease. N Engl J Med. 2019. 381(1):64-74.
[3] Zhao X, Collins RL, Lee WP, et al. Expectations and blind spots for structural variation detection from long-read assemblies and short-read sequencing technologies.Am J Hum Genet.  2021. 108(5):919-928.
[4] Beyter D, Ingimundardottir H, Oddsson A, et al. Long-read sequencing of 3,622 Icelanders provides insight into the role of structural variants in human diseases and other traits. Nat Genet. 2021. 53(6):779-786.
[5] Wu Z, Jiang Z, Li T, et al. Structural variants in the Chinese population and their impact on phenotypes, diseases and population adaptation. Nat Commun. 2021. 12(1): 6501.
[6] Yamaguchi K, Kasajima R, Takane K, et al. Application of targeted nanopore sequencing for the screening and determination of structural variants in patients with Lynch syndrome.  J Hum Genet. 2021. 66(11):1053-1060.
[7] Watson CM, Holliday DL, Crinnion LA, Bonthron DT. Long-read nanopore DNA sequencing can resolve complex intragenic duplication/deletion variants, providing information to enable preimplantation genetic diagnosis. Prenat Diagn. 2022. 42(2):226-232
[8] Dierckxsens N, Li T, Vermeesch JR, Xie Z. A benchmark of structural variation detection by long reads through a realistic simulated model. Genome Biol. 2021. 15;22(1):342. 2021年12月，齊碳科技通過5年的自主研發(fā)，成功推出國內(nèi)首臺商業(yè)化的納米孔基因測序儀QNome-3841，并宣布首個生產(chǎn)基地竣工，正式開啟納米孔基因測序國產(chǎn)化時代。2022年6月，齊碳科技發(fā)布納米孔基因測序儀QNome-3841hex，標志著國產(chǎn)納米孔基因測序儀開始了矩陣化發(fā)展，這也為靈活測序場景提供全新的解決方案，將更好地滿足市場應(yīng)用的多元需求。 齊碳秉承從上游推動行業(yè)發(fā)展的理念和對前沿技術(shù)的探索精神，保持開放、合作的態(tài)度，期待和產(chǎn)業(yè)同仁攜手共進，探索國產(chǎn)納米孔基因測序技術(shù)在多場景中的優(yōu)勢和廣闊的市場前景，構(gòu)建納米孔基因測序的生態(tài)平臺，共同為中國醫(yī)療健康事業(yè)的穩(wěn)健發(fā)展貢獻智慧和力量。