熒光定量PCR對(duì)照詳解

前言

吾日三省吾身，定量實(shí)驗(yàn)做對(duì)照了嗎？

在熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中遇到?jīng)]有曲線、曲線異常等情況，我們總是會(huì)在第一時(shí)間去看陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照的擴(kuò)增情況來(lái)分析原因。由此可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)中做對(duì)照的重要性不言而喻。

在熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中，我們通常會(huì)按照如下的流程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：樣品采集，運(yùn)輸，樣品處理，核酸提取，反轉(zhuǎn)錄（RNA 病毒），擴(kuò)增 ，結(jié)果讀取。為了提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精準(zhǔn)度，我們通常會(huì)通過(guò)設(shè)置對(duì)照的方式對(duì)檢測(cè)的各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行監(jiān)控。

陰性對(duì)照

熒光定量PCR的靈敏度較高，對(duì)實(shí)驗(yàn)室的污染也非常敏感，陰性對(duì)照可以用來(lái)監(jiān)控和發(fā)現(xiàn)污染的發(fā)生。常用的陰性對(duì)照包括以下幾種：

無(wú)模板對(duì)照（No Template Control, NTC）

使用水代替熒光定量 PCR反應(yīng)中的核酸，其它試劑按比例正常加入，用于監(jiān)控?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系中的污染。正常情況下，NTC孔不會(huì)有擴(kuò)增；當(dāng)NTC出現(xiàn)擴(kuò)增，則預(yù)示體系中有污染。在SYBR Green實(shí)驗(yàn)中，引物二聚體的形成也可能導(dǎo)致NTC出現(xiàn)擴(kuò)增。

陰性樣本對(duì)照（Negative Sample Control）

陰性樣本對(duì)照指不含有目的基因或者靶序列的樣本，也可以是樣本保存液。和含有目的基因的樣本一起進(jìn)行核酸提取等過(guò)程。如果出現(xiàn)擴(kuò)增，則說(shuō)明實(shí)驗(yàn)過(guò)程中存在污染，結(jié)合NTC結(jié)果進(jìn)行判斷。

無(wú)逆轉(zhuǎn)錄酶對(duì)照（No Reverse-Transcriptase Control, No RT）

當(dāng)進(jìn)行RNA定量實(shí)驗(yàn)時(shí)，如果引物和探針設(shè)計(jì)在同一個(gè)外顯子上，擴(kuò)增有可能來(lái)源于未去除干凈的DNA，此時(shí)可以設(shè)置無(wú)逆轉(zhuǎn)錄酶對(duì)照。無(wú)逆轉(zhuǎn)錄酶對(duì)照中不加逆轉(zhuǎn)錄酶。由于沒(méi)有cDNA，DNA聚合酶無(wú)法擴(kuò)增mRNA，則不應(yīng)發(fā)生擴(kuò)增。如果檢測(cè)到擴(kuò)增，則樣本中可能含有未去除干凈的DNA。

陽(yáng)性對(duì)照

陽(yáng)性對(duì)照必然是陽(yáng)性的結(jié)果，用于排除假陰性。如果檢測(cè)出來(lái)了這個(gè)樣本不是陽(yáng)性，則說(shuō)明實(shí)驗(yàn)有問(wèn)題，不可靠。

陽(yáng)性樣本對(duì)照（Positive Sample Control）

陽(yáng)性內(nèi)對(duì)照雖然可以在一定程度上反應(yīng)核酸提取效率，但是卻很難反饋提取流程中對(duì)核酸釋放的效率。為了能更好的反映提取效率，可以選擇已知陽(yáng)性的樣本或者保存在相似基質(zhì)中已知濃度的病原體，作為單獨(dú)的樣本進(jìn)行提取和后續(xù)的RT-PCR，通過(guò)Ct值評(píng)斷實(shí)驗(yàn)流程。

內(nèi)參基因（Endogenous Control）

內(nèi)參基因可以用于反應(yīng)樣本本身的質(zhì)量，比如拭子是否刮取到樣本、RNA在運(yùn)輸和保存過(guò)程中是否有嚴(yán)重的降解等問(wèn)題。內(nèi)參基因一般選擇在取樣組織或細(xì)胞中均有足量表達(dá)的基因，且其表達(dá)量不受環(huán)境、實(shí)驗(yàn)處理?xiàng)l件和取樣時(shí)間等因素影響，常用內(nèi)參基因如表1所示。沒(méi)有某個(gè)內(nèi)參基因是萬(wàn)能的，內(nèi)參基因需要根據(jù)樣本類型和實(shí)驗(yàn)處理方式進(jìn)行評(píng)估和選擇。實(shí)驗(yàn)中通過(guò)內(nèi)參基因的Ct值來(lái)判斷取樣和樣本降解情況。在相對(duì)定量實(shí)驗(yàn)中，內(nèi)參基因亦可用于對(duì)取樣量進(jìn)行均一化。

▲ 表1: 已報(bào)道的部分物種qPCR內(nèi)參基因

擴(kuò)增對(duì)照（Amplification Control）

可使用含有擴(kuò)增片段的質(zhì)粒、假病毒或者基因組DNA/cDNA作為擴(kuò)增陽(yáng)性對(duì)照，監(jiān)控?zé)晒舛�量PCR的體系是否正常。當(dāng)擴(kuò)增對(duì)照沒(méi)有擴(kuò)增，或者Ct值大于預(yù)期，則說(shuō)明定量PCR體系存在問(wèn)題。

內(nèi)部陽(yáng)性對(duì)照（Internal Positive Control, IPC）

如果想監(jiān)控每一份樣本的整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程，可以在提取之前在每個(gè)樣本中加入一段外源DNA或RNA（不含目的片段），并在定量PCR時(shí)進(jìn)行單管多重PCR，同時(shí)檢測(cè)目的基因和這段序列。在每個(gè)樣本中加入特定拷貝數(shù)的IPC，進(jìn)而從該段序列的Ct值判斷對(duì)應(yīng)樣品孔中的核酸富集和擴(kuò)增效率。