Cell文章研究解析：如何開發(fā)帕金森抑制劑

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，最主要的病理改變是中腦黑質(zhì)多巴胺（dopamine, DA）能誘導(dǎo)神經(jīng)元的變性死亡，由此而引起紋狀體DA含量顯著性減少而致病。典型的癥狀就是無力、遲緩、僵硬…
 
等等，陳老濕怎么最近也有這種感覺。。。哦，不對，這是天氣太熱，各地高溫頻頻鬧得。。。

說回正題，為了探究PD的確切病因，美國約翰霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院Dawson實驗室曾命名了一種新的程序性細(xì)胞壞死形式——Parthanatos，又稱PARP-1 dependent cell death，是基于DNA損傷，PARP-1激活的細(xì)胞壞死。這種細(xì)胞死亡廣泛地存在于不同的器官不同的疾病中，包括帕金森病、阿爾茨海默癥、多發(fā)性硬化癥、亨廷頓氏舞蹈病等。


圖1

近期，Dawson團(tuán)隊又有了重磅發(fā)現(xiàn)——抑制PAAN/MIF核酸酶可防止帕金森病的神經(jīng)退行性，相關(guān)《Cell》文章于2022年5月10日在線發(fā)表。該研究揭示了病理性α-突觸蛋白（α-syn）誘導(dǎo)的神經(jīng)變性是通過Parthanatos相關(guān)凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）核酸酶（PAAN）/巨噬細(xì)胞遷移抑制因子（MIF）的核酸酶活性發(fā)生的。PAAN/MIF的遺傳耗竭和缺乏核酸酶活性的突變體可防止散發(fā)性PD的α-syn預(yù)成纖維（PFF）小鼠模型中多巴胺能神經(jīng)元的缺失和行為缺陷。通過化合物篩選，研究人員發(fā)現(xiàn)了PAANIB-1—— 一種腦滲透性的PAAN/MIF核酸酶抑制劑，可以防止α-syn PFF、AAV-α-syn過表達(dá)或MPTP中毒在體內(nèi)誘發(fā)的神經(jīng)退行性。這項發(fā)現(xiàn)可能在人類神經(jīng)退行性病癥中具有廣泛的意義。
 
 
陳老濕帶大家整理下研究思路：
1  敲除或者耗竭PAAN/MIF核酸酶活性可以減少α-syn PFF引起的病理變化
2  證明PAAN/MIF核酸酶活性誘導(dǎo)的基因組DNA裂解和神經(jīng)元死亡
3  構(gòu)建篩選平臺，通過受體蛋白復(fù)合物篩選小分子化合物庫
4  優(yōu)化小分子結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行藥代動力學(xué)分析
5  動物實驗評估藥物的特性
 
首先，研究人員通過基因敲除(KO)和突變(E22Q、P2G)，利用腺相關(guān)病毒（AAV）在MIF KO小鼠中表達(dá)PAAN/MIF WT、PAAN/MIF E22Q和MIF P2G的基因，證實PAAN/MIF的核酸酶活性，而不是MIF的異構(gòu)酶酶活性，是α-syn PFF誘導(dǎo)的體內(nèi)神經(jīng)退行性病變所必需的（圖 2）。
 

圖2通過刪除PAAN/MIF的核酸酶活性，α-Syn PFF誘導(dǎo)的病理學(xué)特征減少
 
接著，研究人員確定了PAAN/MIF核酸酶轉(zhuǎn)位介導(dǎo)了α-syn PFF誘導(dǎo)的基因組DNA裂解和神經(jīng)元死亡。AIF和PAAN/MIF在α-syn PFF給藥后相互作用，它們在細(xì)胞核內(nèi)共同定位（圖3C）。PAAN/MIF WT、E22Q和MIF P2G在對α-syn PFF的反應(yīng)中的核轉(zhuǎn)位沒有差異。敲除PAAN/MIF可以防止α-syn PFF誘導(dǎo)的基因組DNA裂解（圖3D）、細(xì)胞死亡（圖3E和3F）。在MIF KO神經(jīng)元中，通過慢病毒表達(dá)PAAN/MIF WT和MIF P2G可恢復(fù)基因組DNA的裂解和細(xì)胞死亡，但在用PAAN/MIF E22Q和AIF結(jié)合缺陷突變體PAAN/MIF E22A的神經(jīng)元中未觀察到DNA裂解和細(xì)胞死亡（圖3D-3F）。在PAAN/MIF E22Q和MIF P2G回補的神經(jīng)元中也得到了類似的結(jié)果。這些數(shù)據(jù)表明，PAAN/MIF的核酸酶活性及其與AIF的結(jié)合對基因組DNA的裂解和α-syn PFF誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡是必需的。
 

圖3PAAN/MIF核酸酶活性是預(yù)防α-syn PFF誘導(dǎo)神經(jīng)毒性的關(guān)鍵
 
在確認(rèn)了PAAN/MIF核酸酶活性是誘導(dǎo)α-syn PFF引發(fā)病理性變化的關(guān)鍵證據(jù)后，研究人員構(gòu)建了一個基于熒光顯色的DNA完整性篩選平臺（圖4A）。當(dāng)MIF具有核酸酶活性就可以結(jié)合到基因組DNA上，從而破壞DNA雙鏈完整性，導(dǎo)致熒光信號降低或消失。當(dāng)抑制劑與MIF結(jié)合后，MIF不再具備核酸酶活性，因此熒光信號正常顯示。通過這一平臺的構(gòu)建，研究人員篩選了具有45,000個候選分子的化合物庫。經(jīng)過多輪篩選，最終找到了編號C8的化合物能防止用人α-syn PFF處理的人皮質(zhì)神經(jīng)元的基因組DNA裂解（圖4G和4H），并且可以在口服后仍具有穿過血腦屏障（Blood Brain Barrier）的能力。
 

圖4PAAN/MIF核酸酶抑制劑的篩選與鑒定
 
為了優(yōu)化C8的效力并增加其中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）的滲透性，研究人員設(shè)計了一個C8衍生物，優(yōu)化后命名為C8-31（以下稱為parthanatos-associated nuclease inhibitor-1，PAANIB-1），它與C8的不同之處在于增加了一個氟（圖5B）。PAANIB-1能有效地抑制PAAN/MIF核酸酶的活性和Parthanatic細(xì)胞的死亡（圖5A）。PAANIB-1抑制MNNG誘導(dǎo)的Parthanatic細(xì)胞死亡的IC50為0.28 μM，C8的IC50為0.52 μM（圖5C）。PAANIB-1與C8相似，通過抑制PAAN/MIF核酸酶的活性，保護(hù)神經(jīng)元免受α-syn PFF引起的突觸障礙、NAD+減少和細(xì)胞死亡。
 

圖5PAANIB-1是一種PAAN/MIF核酸酶抑制劑
 
然后，研究人員需要確定PAANIB-1如何影響PAAN/MIF核酸酶，首先就要判斷PAANIB-1與PAAN/MIF是否直接結(jié)合？
 
 
PAAN/MIF與PAANIB-1的結(jié)合實驗不出意外地選用了Octet® BLI（生物層干涉）分子互作分析系統(tǒng)進(jìn)行定量檢測，結(jié)果表明二者的親和力KD值為1.56 μM（圖6A）。
 
研究人員構(gòu)建PAAN/MIF三聚體模型，預(yù)測了PAAN/MIF的61-64、67-68、73、98-100和106位的氨基酸是潛在的PAANIB-1結(jié)合點。對推定結(jié)合位點周圍的每個殘基進(jìn)行了丙氨酸突變。其中，在PAAN/MIF L62A、PAAN/MIF 61-64A和PAAN/MIF N73A突變體中，PAANIB-1對MNNG誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的保護(hù)作用明顯減弱（圖6C）。進(jìn)一步測定PAAN/MIF WT和丙氨酸突變體與PAANIB-1的結(jié)合動力學(xué)，結(jié)果表明，PAAN/MIF WT和Y100A突變體與PAANIB-1結(jié)合，而L62A和N73A突變體的結(jié)合明顯減弱（圖6D）。
 

圖6PAANIB-1與PAAN/MIF的抑制作用機(jī)制是直接相互作用
 
文章最后，作者將PAANIB-1作為口服藥物，通過小鼠實驗的行為能力測試評估及病理實驗證實PAANIB-1是一個具有成藥潛力的小分子核酸酶抑制劑。這在開發(fā)靶向可藥物化的PAAN/MIF核酸酶的細(xì)胞死亡抑制劑方面提供了啟示和指導(dǎo)作用。

Summary

縱觀整篇文章，作者結(jié)合目前常用的實驗技術(shù)方法和手段，完成了出色的研究工作。其中體外的互作驗證，采用BLI方法進(jìn)行的蛋白與小分子結(jié)合動力學(xué)實驗�；�于BLI的Octet®是檢測結(jié)合動力學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)方法學(xué)之一，已經(jīng)被寫入美國藥典�？焖贉�(zhǔn)確，結(jié)實耐用，成本低~
Octet® 分子互作分析系統(tǒng)

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-參考文獻(xiàn)-
Park et al., PAAN/MIF nuclease inhibition prevents neurodegeneration in Parkinson’s disease, Cell (2022).https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.04.020