Nature文獻(xiàn)解讀：具有更持續(xù)更強(qiáng)的殺傷力的改良T細(xì)胞

TCR-T，CAR-T等細(xì)胞治療是目前很有前途的腫瘤療法，是將患者自身的T細(xì)胞進(jìn)行改造得來(lái)，但是狡猾的腫瘤細(xì)胞不會(huì)束手就擒，T細(xì)胞在殺傷腫瘤細(xì)胞過(guò)程中會(huì)衰竭，殺傷能力大大減弱。最新的一篇《Nature》文章通過(guò)改造T細(xì)胞的基因，對(duì)T細(xì)胞充能，使其具備持續(xù)殺傷腫瘤細(xì)胞的能力，而且擊殺效率更高[1]！


來(lái)自Gladstone–UCSF基因免疫學(xué)研究所的科研人員，通過(guò)CRISPR基因編輯方法發(fā)現(xiàn)了一個(gè)RASA2基因可以使得T細(xì)胞在多種免疫抑制劑的情況下依然能保持增殖，RASA2是一種RASgtpase激活蛋白(RasGAP)，也是人類T細(xì)胞的信號(hào)檢查點(diǎn)，在急性T細(xì)胞受體刺激時(shí)下調(diào)。
 
這篇文章用的主流技術(shù)就是Incucyte® 實(shí)時(shí)活細(xì)胞分析系統(tǒng)，對(duì)T細(xì)胞體外殺傷活性做了全面分析：
1  在免疫抑制下能不能殺
2  低靶點(diǎn)表達(dá)量下能不能殺
3  能殺多久
4  TCR-T和CAR-T能不能都?xì)?br />  
 
T細(xì)胞“充能”基因篩選方法

將CRISPR基因編輯后的T細(xì)胞用CFSE染色，加入各種免疫抑制劑或者Treg細(xì)胞（一種可以負(fù)調(diào)節(jié)T細(xì)胞活性的細(xì)胞），通過(guò)FACS篩選能提高T細(xì)胞增殖活性的基因，發(fā)現(xiàn)RASA2敲除的T細(xì)胞在所有免疫制劑存在下仍具有增殖活性。Sartorius的iQue® 高通量流式細(xì)胞儀（點(diǎn)擊查看產(chǎn)品手冊(cè)）非常適合這個(gè)篩選工作。
 

左圖：用FACS測(cè)試，低CFSE信號(hào)的細(xì)胞群百分比越高，則增殖（Dividing）活性越高。右圖：RASA2敲除的T細(xì)胞，在諸如Adenosine等免疫抑制劑存在下具有更多的CFSE低信號(hào)的細(xì)胞群，說(shuō)明其仍居有良好的增殖活性。
 
 
敲除RASA2的T細(xì)胞
在免疫抑制條件下仍有殺傷活性

為了驗(yàn)證敲除RASA2基因的T細(xì)胞活性，作者構(gòu)建了CD19陽(yáng)性和NY-ESO- 1陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞，目前T細(xì)胞治療手段主要是TCR-T和CAR-T，作者同時(shí)構(gòu)建了針對(duì)CD19和NY-ESO-1的CAR（嵌合抗原受體）和TCR（T細(xì)胞受體），并用Incucyte® 測(cè)試了TCR-T和CAR-T在各種免疫抑制劑和Treg細(xì)胞存在下的殺傷活性。
 


針對(duì)NY-ESO-1的TCR-T在Treg細(xì)胞存在下對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用：用Incucyte® 實(shí)時(shí)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞A375-RFP+細(xì)胞數(shù)量。對(duì)照組在Treg細(xì)胞存在情況下對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷作用減弱，而RASA2 KO細(xì)胞不受Treg細(xì)胞影響。

TCR-T對(duì)NY-ESO- 1陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞的殺傷作用：RASA2敲除的T細(xì)胞在各種免疫抑制劑下的殺傷作用比對(duì)照強(qiáng)。Incucyte® 實(shí)時(shí)檢測(cè)A375-RFP+細(xì)胞數(shù)量。
 
 
敲除RASA2的T細(xì)胞
能增加殺傷活性

作者構(gòu)建了不同CD19+表達(dá)水平的Nalm6腫瘤細(xì)胞，并將anti-CD19的CAR基因轉(zhuǎn)染到RASA2敲除的T細(xì)胞建立針對(duì)CD19的CAR-T細(xì)胞療法。繼續(xù)用Incucyte® 檢測(cè)CAR-T的細(xì)胞殺傷活性，發(fā)現(xiàn)RASA2 KO的T細(xì)胞通過(guò)提高對(duì)靶點(diǎn)表達(dá)量敏感度來(lái)增加殺傷作用。

不同效靶比，不同CD19表達(dá)量的腫瘤細(xì)胞的殺傷作用發(fā)現(xiàn)，RASA2敲除的T細(xì)胞對(duì)CD19表達(dá)量很低的腫瘤細(xì)胞具有良好的殺傷作用。用Incucyte® 檢測(cè)和計(jì)算死細(xì)胞染料Annexin V的熒光面積。
  
 
敲除RASA2的T細(xì)胞
具有持續(xù)殺傷活性

體外細(xì)胞殺傷往往只有幾天時(shí)間，為了檢測(cè)T細(xì)胞的持續(xù)殺傷效果，作者進(jìn)行了6輪殺傷，每次殺傷持續(xù)72小時(shí)。
 

左圖：TCR-T細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)即使在第六輪（Last Stim），與對(duì)照相比，RASA2 KO的T細(xì)胞殺傷作用依然明顯。
右圖：CAR-T細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)即使在第六輪（Last Stim），與對(duì)照相比，RASA2 KO的T細(xì)胞殺傷作用依然明顯。
 
CAR-T細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)即使在第六輪（Last Stim），與對(duì)照相比，RASA2 KO的T細(xì)胞殺傷作用依然明顯。

本文用Incucyte® 做了包括TCR-T，CAR-T以及持續(xù)殺傷各種細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)，為什么選用Incucyte® 呢？

• 培養(yǎng)箱內(nèi)可長(zhǎng)達(dá)數(shù)周的連續(xù)觀察，最短幾分鐘間隔拍攝，減少人力，防止過(guò)多操作對(duì)細(xì)胞的傷害；這篇文章最長(zhǎng)做了共計(jì)18天的六輪殺傷實(shí)驗(yàn)，每隔2-3小時(shí)自動(dòng)拍攝。
• 6個(gè)板位，分別獨(dú)立設(shè)置檢測(cè)程序，可以兼容各種孔板和培養(yǎng)皿，通量高；這篇文章有各種免疫抑制劑、效靶比等實(shí)驗(yàn)組，Incucyte® 一次可以完成所有實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)。
• 高效簡(jiǎn)便的模塊化軟件設(shè)置和數(shù)據(jù)分析，輸出圖片、視頻、生長(zhǎng)曲線等多指標(biāo)多參數(shù)；本文主要用到熒光計(jì)數(shù)并歸一到第一時(shí)間點(diǎn)等功能。
• 大于100種優(yōu)化過(guò)的活細(xì)胞專用熒光試劑、耗材及詳盡的Protocol。本文用了配套的Annexin V試劑。

如果您不想再把細(xì)胞拿進(jìn)拿出的拍攝，來(lái)試試Incucyte® 吧！

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下載《CAR-T 細(xì)胞進(jìn)行表型和功能表征》白皮書，了解更多Incucyte® 實(shí)時(shí)活細(xì)胞成像技術(shù)與iQue® 高通量流式在腫瘤免疫學(xué)中的應(yīng)用。

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-參考文獻(xiàn)-
RASA2 ablation in T cells boosts antigen sensitivity and long-term function.Nature 2022