生物芯片掃描儀和微陣列可用于抗擊傳染性疾病

 

病毒、細菌和寄生蟲可引起有害疾病，對于這些疾病需要快速有效的檢測和治療工具。感染和致病機制鮮為人知的新傳染病是科學研究和臨床治療的巨大挑戰(zhàn)。研究病原體與宿主的相互作用、抗原表位和患者免疫反應對于開發(fā)新的疾病預防或治療方法（如疫苗和新藥）至關重要。同時，流行病學研究中大型患者隊列的眾多樣品，需要自動化和高通量的樣品處理方式。值得注意的是，微陣列和 InnoScan 熒光掃描儀可用于傳染病研究的任何步驟，從病原體檢測到疫苗驗證。使用專門的聚糖陣列，研究人員現(xiàn)在能夠解析病毒和細菌感染的精確機制。同樣，高密度多肽微陣列是了解免疫反應、解析抗原表位以及設計和驗證疫苗的寶貴工具。
 

圖1.聚糖微陣列傳染病相關應用案例
 

微陣列是由精確排列在載體表面（通常是顯微鏡載玻片）已知位置上的生物分子（核酸、蛋白質、多肽、聚糖等）組成的微型矩陣。將患者血清、細胞裂解物或純化的 DNA 等樣品孵育到微陣列上。然后使用 InnoScan 等熒光掃描儀，以更高的靈敏度和更寬的動態(tài)范圍檢測熒光，收集可靠數(shù)據(jù)。微陣列優(yōu)于其他技術，因為它們能夠同時檢測多種相互作用，具有高通量能力，可以使用少量的試劑和樣品來測試大量樣本。
 

DNA微陣列可以檢測病毒或細菌等病原體。微陣列的多指標檢測能力允許在一張載玻片上檢測不同的病毒。一個DNA 微陣列可以同時測試 100 種不同的病毒。2015 年，Martinez¹ 等人設計了一種 DNA 微陣列，用于同時檢測與兒童胃腸炎有關的各種胃腸道病毒。作者驗證了使用 DNA 微陣列檢測 10 種不同的病毒，其具有與RT-PCR 相似或更高的靈敏度。研究人員還指出，DNA 微陣列可用于解析一種以上病毒的共感染，有助于了解兒童胃腸炎的病因。同樣，由 Khan MJ 等人開發(fā)的 SMAvirusChip 是一種 DNA 微陣列，旨在檢測由小型哺乳動物和節(jié)肢動物傳播的病毒²。SMAvirusChip v2微陣列芯片包含 8 個區(qū)域，每個區(qū)域具有 15,000 個60 堿基寡核苷酸探針，能夠檢測 416 種病毒，包括登革熱 (DENV) 和寨卡病毒。作者使用連續(xù)稀釋的登革熱病毒樣品測試了 SMAvirusChip v2 的靈敏度，并將其與經(jīng)典 RT-PCR 進行比較。結果顯示其比RT-PCR 靈敏度低10倍，檢測下限為2600 RNA 拷貝每毫升。這些研究共同證明了使用 DNA 微陣列作為患者病毒監(jiān)測和篩查工具是有效的。最近，Sultankulova 等人，設計了一種用于診斷禽病毒性疾病的寡核苷酸微陣列。他們使用 InnoScan 710 掃描儀檢測確定鳥類樣本中存在不同禽病毒的熒光信號³。該實驗成功地用于一項旨在了解哈薩克斯坦野生鳥類中1型禽流感病毒分子流行病學的大范圍研究⁴。該研究包括來自哈薩克斯坦 9 個地區(qū) 37 個科鳥類的 860 個泄殖腔拭子樣本。該項研究結果有希望解析病毒基因型并建立病毒傳播地圖。這項工作展示了 DNA 寡核苷酸微陣列作為流行病學研究和病毒監(jiān)測高通量工具的潛力。

 

使用 DNA 或蛋白質陣列的細菌血清分型有助于區(qū)分引發(fā)不同免疫反應的細菌。2010 年 Marimon 等人成功開發(fā)了一款抗體微陣列來進行肺炎鏈球菌血清分型⁵。這種蛋白質血清分型微陣列由針對 83 或 91 肺炎鏈球菌血清特異性抗體組成。

 

特定的細菌和抗體結合之后，通過熒光抗體進行檢測。InnoScan 710 掃描儀和 Mapix 軟件分別用于熒光信號的獲取和定量分析。與細菌血清分型的標準方法 Quellung 技術相比，抗體微陣列顯示出更好的特異性和更短的實驗時間。此外，抗體微陣列的多指標檢測能力允許在同一實驗中檢測交叉反應抗體，而經(jīng)典方法不具備這一能力。

 

由于缺乏特定的身體癥狀或臨床標志物，一些疾病難以診斷。例如，上呼吸道疾病可能是由多種病毒引起，但它們具有相同的臨床癥狀。診斷困難會使患者診斷復雜化并影響流行病學監(jiān)測。為了解決這個問題，俄羅斯圣彼得堡 Smorodintsev 流感研究所的 Marina Plotnikova 開發(fā)了一種抗體微陣列，能夠區(qū)分上呼吸道疾病六種常見病毒：IAV、IBV、RSV、hAdV、hPIV2 和 hPIV3⁶。

 

該檢測是一種基于微陣列的微縮化多重 ELISA 夾心實驗，其檢測限略低于經(jīng)典 ELISA。該檢測方法的優(yōu)勢在于多指標檢測和節(jié)省時間。作者聲稱有可能將同時檢測的病原體種類增加到約 50 種。
 

為了開發(fā)抵抗病原體感染的有效策略，需要研究病原體引起感染的機制。病毒感染通常由病毒蛋白（衣殼蛋白或糖蛋白）和宿主細胞表面受體之間的一種或幾種特異性相互作用引發(fā)。而細菌的發(fā)病機制是由細菌表面糖蛋白介導的，這有時使它們能夠逃避人體免疫系統(tǒng)。因此，通過病毒或細菌聚糖結合蛋白 (GBP) 與宿主細胞膜聚糖之間的相互作用，聚糖對于病原體致病能力至關重要。
 

 

通過聚糖微陣列可以深入了解這些相互作用，為藥物和疫苗的開發(fā)提供線索。

 

典型的聚糖微陣列工作流程從聚糖微陣列構建開始。使用芯片點樣儀將聚糖或凝集素點樣在功能化修飾的載玻片表面。聚糖和凝集素分子通過共價結合或非共價鍵吸附和芯片表面進行固定，這取決于芯片表面的修飾類型。該聚糖陣列用于從樣品中捕獲聚糖結合分子例如聚糖結合蛋白、病毒、細胞或其他。熒光染料可用于檢測聚糖結合蛋白和聚糖之間的相互作用。在孵育步驟之前將聚糖結合蛋白與熒光基團進行偶聯(lián)，或孵育步驟完成后，在附加步驟中使用針對聚糖結合蛋白的熒光抗體。然后使用微陣列掃描儀檢測熒光。 Innopsys InnoScan 是自動化熒光檢測的理想工具，能夠同時檢測兩種或三種熒光信號，其Mapix 軟件通過圖像分析來對熒光信號進行自動化的定量分析（圖2）。Scripps研究所 McBride 等人開發(fā)了一款含48個微陣列的載玻片芯片來監(jiān)測甲型流感病毒血凝素親和力的特異性⁷。該微陣列可同時檢測 6 種不同聚糖與 6種聚糖結合蛋白在8種稀釋條件下的相互作用。該檢測旨在監(jiān)測禽類病毒是否正在適應人類受體。作者使用 InnoScan 1100 進行實驗。他們使用三個熒光通道的同時檢測來跟蹤芯片上三種不同類型的樣品點：他們在微陣列制作過程中使用 Atto488-NHS 染料作為網(wǎng)格標記，使用鏈霉親和素-555 染料來檢測具有已知特異性且生物素標記的凝集素作為實驗對照；用Alexa 647 標記的抗體，來檢測甲型流感病毒血凝素的受體結合特異性。由此產(chǎn)生的檢測結果與微孔板檢測結果相當，但化學試劑和生物試劑的消耗量分別顯著減少 1,500 倍和 360 倍（圖 3）。凝集素調節(jié)病毒，細菌對宿主組織的粘附，介導定植和感染。細菌與宿主組織相互作用的研究對于了解和預防細菌感染至關重要。由于聚糖是復雜的分子，我們需要能夠有效研究聚糖與凝集素極其復雜多樣相互作用的方法。使用完整細胞的聚糖微陣列是解析幾種細菌凝集素與宿主聚糖結構相互作用的有效工具。使用熒光標記的完整細菌而不是純化的蛋白質，研究人員能夠跟蹤細菌凝集素與宿主候選聚糖結構的相互作用。

 

 

De Olivera 等人⁸ 使用全細胞聚糖陣列揭示了化膿性鏈球菌感染率的高低與宿主糖基化結構多樣性相關。他們發(fā)現(xiàn)M1細菌蛋白對幾種末端半乳糖血型抗原結構顯示出高親和力。細菌對宿主細胞的粘附與血型抗原的表達有關，這解釋了宿主血型抗原表達與A組鏈球菌M1T1克隆(GAS)定植之間的關系。

 

最近，臥龍崗大學和昆士蘭大學的研究人員與澳大利亞格里菲斯大學的糖組學研究所合作，發(fā)表了如何構建聚糖陣列并研究 GAS 與宿主聚糖結構相互作用的完整方法⁹。他們使用 InnoScan 1100 檢測熒光標記的純化蛋白或熒光標記的完整細菌。

 

使用完整細菌的聚糖微陣列可以更全面地分析細菌對宿主器官的粘附和定植。
 

在感染過程中，病原體與宿主的相互作用會觸發(fā)宿主免疫反應，以控制病原體的定植和感染。先天免疫反應包括促炎分子如細胞因子和趨化因子的產(chǎn)生。這種對病原體的非特異性反應是一種快速且通常有效的控制感染過程。當病原體成功逃避先天免疫反應時，T細胞和B細胞等特化免疫細胞被激活，從而啟動適應性免疫反應。因此，炎癥是對抗感染因子的首要機制之一。然而，加劇和不受控制的炎癥會導致宿主組織損傷。細胞因子和趨化因子分泌分析有助于理解先天免疫反應機制，并有助于深入了解如何控制炎癥和避免組織損傷。中國石家莊愛爾眼科醫(yī)院的研究人員使用抗體微陣列和 InnoScan 300-G（現(xiàn)為 InnoScan 710-G）來研究人類角質細胞在 1 型單純皰疹病毒 (HSV-1) 感染期間分泌的細胞因子¹⁰。他們能夠確定相比未感染角質細胞，18 種炎癥相關細胞因子和趨化因子在HSV-1 刺激的角質細胞中表達上調。這些發(fā)現(xiàn)為控制 HSV-1 感染和避免先天免疫反應失衡所引起的過度疤痕和組織損傷，提供治療相關洞見。
 

InnoScan 710 適用于中高密度的芯片	InnoScan 1100 適用于超高密度的芯片

 

Innopsys 成立于1999年�？偛课挥诜▏�。分部設立于美國的芝加哥。一直致力于生物醫(yī)學領域相關儀器和軟件的自主研發(fā)和生產(chǎn)。Innoscan系列掃描儀，采用先進的多共聚焦掃PMT檢測器和多激光掃描光路，可以同時進行多通道檢測。不僅有效降低了熒光光漂白現(xiàn)象以及信號損失，還可以有效的縮短掃描時間。掃描過程中，可實時自動聚焦。根據(jù)芯片片基高度變化，自動調節(jié)焦距以獲得最佳掃描結果。Innoscan系列不僅是擁有快速、高分辨率和靈活等特點的掃描儀產(chǎn)品系列，更是基因、蛋白、糖類、細胞、組織等多種芯片研究的強大工具。在基因組和蛋白組表達，基因突變，SNP檢測，CGH，細菌病毒檢測，腫瘤特異性標志篩查，病理組織篩查等方面都有非常廣泛的應用。 

 

環(huán)亞生物，生命科學產(chǎn)品全國性代理商，不斷把國外頂級的創(chuàng)新產(chǎn)品引入中國。環(huán)亞生物具備完善的公司運營、產(chǎn)品管理、營銷、售前技術支持和售后維修體系。環(huán)亞生物作為Innoscan大中華區(qū)代理商，負責Innoscan產(chǎn)品大中華區(qū)的營銷和售后支持。
 

1.Martínez MA, Soto-del Río MDLD, et al. 2015. DNA microarray for detection of gastrointestinal  viruses. J Clin Microbiol53:136–145.   DOI:10.1128/JCM.01317-14

2.Khan MJ, Trabuco AC, et al. 2016. DNA Microarray Platform for Detection and Surveillance of Viruses Transmitted by Small Mammals and Arthropods. PLoS Negl Trop Dis 10(9): e0005017.   DOI:10.1371/journal.pntd.0005017

3.Sultankulova K, Kozhabergenov NS, et al. 2017. New oligonucleotide microarray for rapid diagnosis of avian viral diseases. Virol J 14, 69.   DOI:10.1186/s12985-017-0738-0

4.Orynbayev MB, Fereidouni, S, et al. 2018. Genetic diversity of avian avulavirus 1 (Newcastle disease virus genotypes VIg and VIIb) circulating in wild birds in Kazakhstan. Arch Virol 163, 1949–1954.   DOI:10.1007/s00705-018-3815-9

5.Marimon JM, Monasterio A, et al. 2010. Antibody microarray typing, a novel technique for Streptococcus pneumoniae serotyping. J Microbiol Methods 80(3):274-80.   DOI:10.1016/j.mimet.2010.01.011

6.Plotnikova M, Klotchenko SA, et al. 2019. Antibody microarray immunoassay for screening and differential diagnosis of upper respiratory tract viral pathogens. J Immunol Methods 478:112712.   DOI:10.1016/j.jim.2019.112712

7.McBride R, Paulson JC & De Vries RP. 2016. A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins. J. Vis. Exp. (111), e53847.   DOI:10.3791/53847

8.De Oliveira DMP, Hartley-Tassell L, et al. 2017. Blood Group Antigen Recognition via the Group A Streptococcal M Protein Mediates Host Colonization. mBio 8 (1) e02237-16.   DOI: 10.1128/mBio.02237-16

9.Indraratna A, De Oliveira DMP, et al. 2020. Investigation of Group A Streptococcal Interactions with Host Glycan Structures Using High-Throughput Techniques: Glycan Microarray Analysis Using Recombinant Protein and Whole Cells. In: Proft T., Loh J. (eds) Group A Streptococcus. Methods in Molecular Biology, vol 2136. Humana, New York, NY.   DOI:10.1007/978-1-0716-0467-0_10

10.Han Xian-Kui, Wang Hui-Fang, et al. 2020. P38 Inhibition Prevents Herpes Simplex Virus Type 1 (HSV-1) Infection in Cultured Corneal Keratocytes, Current Eye Research.   DOI:10.1080/02713683.2020.1748658

 

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