項目文章： 單細胞測序揭示共刺激分子CD226對胸腺T細胞發(fā)育的影響

2022年11月，第四軍醫(yī)大學聯(lián)合西北工業(yè)大學在學術(shù)期刊IMMUNOLOGY上發(fā)表題為“CD226 knockout reduces the development of CD8+ T by impairing the TCR sensitivity of double-positive thymocytes”的研究成果。本研究通過對野生型(WT)和CD226基因敲除小鼠(KO)的胸腺細胞進行單細胞測序，探索了共刺激分子CD226對于T細胞發(fā)育的重要作用。實驗發(fā)現(xiàn)，CD226KO小鼠胸腺中CD8+ T細胞顯著減少，DPT-Q細胞顯著增加，并且削弱了TCR信號通路中AKT的磷酸化水平，促進DPT細胞凋亡，表明CD226對胸腺細胞發(fā)育有重要影響。新格元在該研究中承擔了單細胞轉(zhuǎn)錄組測序以及單細胞數(shù)據(jù)生信分析等工作。
 
研究背景
T淋巴細胞在胸腺發(fā)育成熟，其經(jīng)歷的陽性選擇是表達不同TCRs的未成熟雙陽性(DP) T細胞成熟為MHC限制性單陽性(SP) T細胞的關(guān)鍵步驟。CD226是一種I型跨膜活化性受體，以往對CD226功能的研究主要集中在外周組織中調(diào)節(jié)免疫的作用。CD226信號通路促進CD8+ T細胞活化，增強細胞毒性，它對抗腫瘤免疫至關(guān)重要，但在胸腺細胞發(fā)育過程中其特征尚不明確。
DPT：共表達CD4/CD8，雙陽性T細胞(DPT)；
DPT-Q：DPT at the quiescent phase靜止期的DPT細胞；
DPT-P：DPT at proliferating phase增殖期的DPT細胞；
DNT：雙陰性T細胞。
   
研究結(jié)果
1.scRNA-seq揭示了CD226在胸腺T細胞發(fā)育中的意義
為了確定CD226分子在胸腺T細胞發(fā)育中的作用，研究者使用Singleron GEXSCOPE平臺對5周齡CD226 KO小鼠和對照的野生型(WT)小鼠的胸腺細胞進行了scRNA-seq(圖1a)。通過質(zhì)量控制并分別獲得了26962個(WT)和26283個(KO)胸腺細胞；利用UMAP對細胞群進行識別和可視化，大多數(shù)胸腺細胞被鑒定為T細胞(圖1b)。然后將T細胞進一步細分聚類為7個亞群，然后使用之前報道的marker進行了注釋(圖1c)，并對T細胞每個cluster的前10個特征基因進行了展示。擬時序分析顯示，WT和CD226KO小鼠的胸腺細胞發(fā)育軌跡如下：DNT、DPT-P、DPT-Q、CD4+/CD8+ SP T細胞(CD4/CD8 T)(圖1c,e)，這與前人的報道一致。
CD226 KO組胸腺細胞各亞群的分布和比例發(fā)生了顯著變化(圖2a)。與WT小鼠相比，CD226KO小鼠的CD8+ SP胸腺細胞比例顯著降低，DPT-Q細胞比例顯著增加(圖2a,b)。然后，研究者又通過流式細胞術(shù)分析證實，CD226敲除降低了胸腺中CD8 T細胞的比例，增加了DPT細胞的比例(圖2c)。通過對DPT-Q、CD4+ T和CD8+ T細胞進行Monocle 2擬時序表明，CD226敲除一定程度上阻止DPT-Q分化為CD8+ T細胞(圖2d,e)。提示CD226在胸腺T細胞的發(fā)育過程中起重要作用，尤其是在DPT-Q向CD8+ T細胞的轉(zhuǎn)化過程中。
2.CD226在DPT期開始高表達 
基于CD226在胸腺T細胞發(fā)育中的重要作用，研究者檢測了WT小鼠中不同發(fā)育階段的T細胞中CD226的表達情況。首先是通過jitter圖顯示了在T細胞分化的假時間過程中CD226的表達(圖3a)，發(fā)現(xiàn)：CD226不表達于DNT期之前的各階段胸腺細胞，在DPT-Q期開始表達，在CD4+、CD8+和NKT細胞等終末分化T細胞中表達最高。接著，采用流式細胞術(shù)檢測WT小鼠胸腺中CD226蛋白的表達水平，發(fā)現(xiàn)：CD226水平按照DNT、DPT、CD4+ T和CD8+ T細胞的順序逐漸升高，其中CD226在DNT中表達最低，但在DPT期顯著升高(圖3b,c)。這表明CD226在DPT細胞中起重要作用。此外，CD8+ T細胞中CD226的表達顯著高于其他亞群，這可能是CD226敲除主要影響了CD8+ T細胞發(fā)育和功能的原因之一。
CD226敲除抑制DPT-Q向CD8+ T細胞的發(fā)育，DPT-Q是T細胞向SP細胞發(fā)育的關(guān)鍵階段。接下來，文章作者進一步對DPT-Q細胞展開研究。首先將DPT-Q細胞進行進一步分群，分為5個亞群，使用UMAP進行數(shù)據(jù)分析和可視化(圖4a)。通過UMAP圖可以看出，CD226敲除導致DPT-Q中缺少簇2、3和5(圖4c)。同時作者也對這些亞群的特征基因以熱圖的形式進行了展示。簇2可以由Granzyme A (Gzma)注釋(圖4e)，而Granzyme A是一種選擇性地表達于CTL和NK細胞的絲氨酸蛋白酶，誘導腫瘤細胞和病毒感染細胞死亡，表明Gzma+ Cluster 2可能進一步發(fā)展為CD8+ T細胞。這些結(jié)果表明，CD226敲除抑制DPT-Q的發(fā)育，Gzma+亞群的缺失可能是CD8+ T發(fā)育障礙的潛在原因。
3.CD226的缺失通過減弱TCR信號強度阻礙了T細胞的陽性選擇
DPT-Q期的陽性選擇對T細胞向SP(單陽性)細胞的發(fā)育至關(guān)重要，DPT細胞只有接收到合適強度的TCR信號，才能通過陽性選擇，繼續(xù)存活和成熟。CD5的水平在陽性選擇過程中受到嚴格的調(diào)控，并且CD5的表達反映了TCR轉(zhuǎn)導信號的強度，CD5+ Cluster 3被鑒定為正在發(fā)生陽性選擇的DPT細胞。接下來，文章作者對CD5+ Cluster 3細胞展開了研究，jitter圖顯示CD5表達增加，之后隨擬時序順序降低，反映了DPT細胞經(jīng)歷陽性選擇的動態(tài)過程(圖5a)。鑒于CD226敲除造成CD5+ Cluster 3細胞的顯著減少(圖4c)，文章作者進一步研究了CD226是否影響DPT細胞的TCR信號強度。基于scRNA-seq的氣泡圖顯示，CD226 KO小鼠的DPT-Q和CD5+ DPT-Q細胞中TCR下游信號分子如Lck、Lat和Zap70的基因表達均下調(diào)(圖5b)。WT和CD226 KO 組DPT細胞之間差異基因的富集分析指向TCR下游的MAPK等相關(guān)信號通路(圖5c)。GO富集分析也顯示了TCR信號的一致結(jié)果，如分子功能中的轉(zhuǎn)錄因子和蛋白激酶結(jié)合，細胞成分中的細胞質(zhì)，以及生物過程中的細胞分化(圖5d)。
4.CD226通過調(diào)控AKT活性調(diào)控DPT細胞凋亡
細胞凋亡是胸腺細胞進行陽性選擇和決定成熟單陽性T細胞數(shù)量的最重要機制，研究者通過流式細胞術(shù)檢測了WT和CD226KO小鼠胸腺細胞凋亡水平。WT胸腺細胞和CD226KO胸腺細胞中CD4+和CD8+ SP細胞的百分比沒有顯著差異，而CD226缺陷的DPT細胞顯示出更高的凋亡水平(圖6a)。
AKT通路參與細胞存活/凋亡的調(diào)節(jié)，當TCR被激活時，其下游元件NF-κB、AKT和MAPK發(fā)生級聯(lián)磷酸化。然而，在CD226缺陷的DPT細胞中，AKT在Ser473位點的磷酸化、ERK在Thr202/ Tyr204位點的磷酸化、NF-κB在Ser536位點的磷酸化和P38在Thr180/Tyr182位點的磷酸化顯著降低(圖6b)。與WT DPT細胞相比，CD226缺陷的DPT細胞表現(xiàn)出更高的凋亡水平，AKT激活劑SC79顯著逆轉(zhuǎn)了這種凋亡水平(圖6c)。
同時，促凋亡相關(guān)蛋白Bax和cleaved-caspase 3在CD226缺陷的DPT細胞中表達上調(diào)。AKT抑制劑增強了DPT細胞中Bax和cleaved-caspase 3的表達，AKT激活劑顯著逆轉(zhuǎn)了CD226缺陷的DPT細胞中Bax和cleaved-caspase 3的上調(diào)(圖6d)。上述結(jié)果表明，CD226可以通過調(diào)節(jié)AKT活性來調(diào)控DPT細胞凋亡，TCR信號強度減弱是CD226 KO小鼠陽性選擇受損和胸腺細胞發(fā)育障礙的原因。  
結(jié)論
1、本研究對WT和CD226 KO小鼠胸腺細胞進行了單細胞測序，CD226KO小鼠胸腺中CD8+ T細胞顯著減少，DPT-Q細胞顯著增加，表明CD226對胸腺細胞發(fā)育有重要影響。
2、研究了CD226在胸腺細胞各發(fā)育階段的動態(tài)表達規(guī)律，發(fā)現(xiàn)其在DPT時期開始高表達。
3、DPT-Q細胞被細分為5個細胞亞群，包括CD5高表達的細胞群，而CD226 KO組胸腺中明顯缺乏CD5表達，而另一簇Gzma+ DPT-Q亞群在CD226 KO胸腺中同樣缺失，表明DPT-Q向CD8+ T細胞發(fā)育過程受損。
4、CD226 KO降低了多個TCR下游分子基因的表達，CD226缺陷導致多個TCR信號通路相關(guān)的差異基因富集，包括MAPK通路。
5、通過體外實驗發(fā)現(xiàn)CD226敲除增加了DPT細胞的凋亡水平，而AKT激活劑可以在很大程度上逆轉(zhuǎn)CD226缺失的DPT細胞的凋亡增加。
綜上所述，CD226在DPT細胞陽性選擇過程中協(xié)同pMHC-TCR相互作用，為DPT-Q細胞向SP階段的發(fā)育提供足夠強度的刺激信號，其分子機制與AKT通路抑制DPT細胞凋亡有關(guān)，參與胸腺細胞發(fā)育的調(diào)節(jié)。該發(fā)現(xiàn)為共刺激分子CD226在T細胞分化和成熟中的調(diào)節(jié)作用研究提供了新的實驗數(shù)據(jù)和思路。
 
參考文獻
Jingchang Ma ，Yitian Liu ， Chujun Duan  et al.  CD226 knockout reduces the development of CD8+ T by impairing the TCR sensitivity of double-positive thymocytes. Immunology. 2022 Nov 24. doi: 10.1111/imm.13612.