生物納米孔分析技術(shù)的應(yīng)用、發(fā)展及展望

生物納米孔傳感器背景介紹
生物細(xì)胞新陳代謝所涉及的無(wú)機(jī)離子、葡萄糖、核酸、氨基酸 、蛋白質(zhì)及其它細(xì)胞代謝物的跨膜運(yùn)輸主要是通過(guò)生物膜上的特定的膜通道蛋白來(lái)介導(dǎo)完成的。這些膜通道蛋白是由蛋白質(zhì)單體或多聚體于生物膜上自發(fā)組裝形成的跨膜孔道，是生物細(xì)胞在數(shù)十億年的漫長(zhǎng)生物進(jìn)化過(guò)程篩選出一系列結(jié)構(gòu)最為精簡(jiǎn)、運(yùn)轉(zhuǎn)最為高效的跨膜輸運(yùn)機(jī)制。
 
最近備受大家關(guān)注的著名結(jié)構(gòu)生物學(xué)家顏寧教授的主要研究工作就是細(xì)胞膜上的各種物質(zhì)運(yùn)輸和信號(hào)傳導(dǎo)的跨膜蛋白的結(jié)構(gòu)與功能�？茖W(xué)家們也已將跨膜蛋白改造成為用途各異的生物傳感器，用于檢測(cè)分析各類(lèi)生物活性的分子。
 
生物納米孔(蛋白納米孔)，是指一種可以嵌入到細(xì)胞膜中，形成貫穿膜兩側(cè)的納米尺度孔隙，并作為離子或分子通道的跨膜蛋白。生物納米孔是由蛋白質(zhì)亞單位、肽等嵌入到脂質(zhì)雙層或聚合物膜中自組裝形成的。例如，第一種被廣泛應(yīng)用的生物納米孔α⁃溶血素納米孔(α⁃hemolysin，α⁃HL)(圖1)，是由金黃色葡萄球菌分泌的外毒素α⁃溶血素，插入到磷脂雙分子層膜中自組裝形成的蘑菇狀七聚體，該聚合體中間形成了貫穿膜的孔隙，在最窄的點(diǎn)形成寬度為1.4nm的納米通道。α⁃HL通道的內(nèi)徑和單鏈DNA(ssDNA)分子的直徑非常接近(為1.3nm)，使其可用于分析單鏈DNA分子。
   
生物納米孔傳感器工作原理
科學(xué)家們將納米孔蛋白嵌入到高電阻率的膜上(生物膜或高分子聚合物膜)，開(kāi)發(fā)出了可用于分析單個(gè)分子的傳感器。使用生物納米孔對(duì)單個(gè)分子進(jìn)行分析是建立在膜片鉗技術(shù)基礎(chǔ)上的膜通道仿生技術(shù)(圖2)。其基本原理為在高絕緣性的膜兩側(cè)充滿(mǎn)離子溶液，納米孔蛋白在膜上形成貫穿兩側(cè)的納米尺度的孔道，當(dāng)在膜兩側(cè)施加電壓時(shí)，離子會(huì)流過(guò)絕緣膜上的納米孔，從而產(chǎn)生恒定電流。由于生物納米孔的直徑多為1.0~3.0nm，因此在電場(chǎng)力驅(qū)動(dòng)下只能容許一定物理尺寸的單個(gè)待測(cè)物分子進(jìn)入并穿過(guò)納米孔，當(dāng)單分子通過(guò)納米孔的縮頸時(shí)會(huì)阻擋恒定的離子流(電阻抗效應(yīng))，進(jìn)而造成電流的下降，下降的幅度和延續(xù)的時(shí)間與通過(guò)納米孔的單分子的粒徑、基團(tuán)的電荷狀態(tài)和長(zhǎng)度等特征緊密相關(guān)，因此可利用電場(chǎng)力驅(qū)動(dòng)單個(gè)分子通過(guò)納米孔引起的皮安級(jí)電流變化來(lái)表征單分子的信息。[1]  
不同性狀的待測(cè)物分子通過(guò)不同理化性質(zhì)的納米孔蛋白時(shí)，產(chǎn)生阻斷電流的程度、頻率及時(shí)間不同，通過(guò)對(duì)大量阻斷電流信號(hào)的統(tǒng)計(jì)分析，可在單分子水平獲取分子的尺寸、結(jié)構(gòu)及電荷等信息(圖3)。[2]  
將生物納米孔作為“天然傳感器”并用于分析生物、化學(xué)分子的技術(shù)始于20世紀(jì)90年代中期。1996年，Deamer和Branton教授等首次證實(shí)了單個(gè)單鏈DNA(ssDNA)分子和RNA分子可通過(guò)由金黃色葡萄球菌 α-溶血素( α-Hemolysin, α-HL)構(gòu)建的天然納米孔通道，并且能檢測(cè)到它們通過(guò)這種納米級(jí)孔道時(shí)所造成的電流改變。[3]
 
基于這一研究結(jié)果，Deamer、Branton和Church教授等進(jìn)一步提出了根據(jù)不同種類(lèi)堿基通過(guò)納米孔時(shí)產(chǎn)生的特征電流阻斷信號(hào)來(lái)推導(dǎo)出單鏈核酸的堿基序列信息，并最終實(shí)現(xiàn)對(duì)單分子核酸鏈的堿基序列測(cè)定(圖4)。該研究開(kāi)創(chuàng)了利用生物納米孔高效分析生物、化學(xué)分子的新時(shí)代。目前生物納米孔分析技術(shù)已逐步發(fā)展成為重要的單分子分析手段，憑借其分析靈敏度高（超高的時(shí)間分辨率~10 μs和電流分辨率<0.1 pA）、快速、低成本及無(wú)需分子修飾標(biāo)記(如熒光標(biāo)記、放射性標(biāo)記)或表面固定等優(yōu)勢(shì)，使得其在生物和化學(xué)等諸多領(lǐng)域應(yīng)用前景廣泛。  
生物納米孔可以通過(guò)多種方式形成，孔徑范圍分布較大(圖5)。通過(guò)基因工程技術(shù)，可得到不同孔徑大小、縮頸高度的用于分析不同分子的納米孔蛋白。生物體中許多進(jìn)程都會(huì)涉及到生物聚合鏈穿越嵌入生物膜上通道, 這些通道和生物大分子在空間結(jié)構(gòu)尺度上與納米技術(shù)相吻合, 因此生物納米孔技術(shù)的發(fā)展為核酸、蛋白質(zhì)等生物分子識(shí)別的研究提供了更多的可能性。利用構(gòu)建的各種不同孔徑和表面特性的納米孔蛋白，可對(duì)離子、DNA、RNA、氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、藥物分子、聚合物大分子等各種物質(zhì)進(jìn)行分析表征。  
一般情況下，生物納米孔的尺寸應(yīng)與分析物的尺寸相當(dāng)(圖6)，以便被分析物產(chǎn)生出可測(cè)量的高信噪比的電流振幅變化。經(jīng)基因工程定向改造或化學(xué)修飾得到的生物納米孔，可以進(jìn)一步增強(qiáng)納米孔與被分析物之間的相互作用，提高其整體靈敏度和選擇特異性。[2] 例如，更大尺寸的生物納米孔，可允許折疊蛋白或結(jié)構(gòu)域等更大的分子進(jìn)入，以便分析蛋白與其他蛋白、藥物或底物的相互作用�？茖W(xué)家甚至開(kāi)發(fā)出了可用于癌癥生物標(biāo)記物檢測(cè)、藥物手性異構(gòu)體拆分等功能性納米孔蛋白。  
生物納米孔分析技術(shù)應(yīng)用與發(fā)展
生物納米孔分析技術(shù)最初是為了對(duì)離子和小分子進(jìn)行監(jiān)測(cè)而開(kāi)發(fā)的。最先得以突破性的應(yīng)用為核酸的測(cè)序領(lǐng)域。得益于其顯著的優(yōu)勢(shì)點(diǎn)：
納米孔能夠以相對(duì)較高的速率逐個(gè)連續(xù)捕獲單個(gè)分子，這使得納米孔能夠在合理的時(shí)間范圍內(nèi)在單分子水平上探索大量分子
納米孔將分析物的結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)轉(zhuǎn)換為可測(cè)量的電流信號(hào)，極大地簡(jiǎn)化了儀器設(shè)備的復(fù)雜程度
納米孔為構(gòu)建仿生系統(tǒng)提供了一個(gè)定義明確的支架，涉及生物分子相互作用的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，為解開(kāi)復(fù)雜生物過(guò)程提供了可行的方法,使得生物納米孔具有超高的動(dòng)態(tài)分辨率，足以分辨小如單個(gè)原子的檢測(cè)分析物，成為名副其實(shí)的單分子分析的多面手，應(yīng)用前景非常廣闊(圖7)
 
目前，生物納米孔分析技術(shù)的應(yīng)用已經(jīng)不限于：DNA/RNA測(cè)序和表觀遺傳修飾分析(堿基序列及堿基修飾識(shí)別)；并以極快的速度拓展到：蛋白質(zhì)/多肽分析(一級(jí)序列、高級(jí)構(gòu)型和構(gòu)象等)、多糖、聚合物、有機(jī)小分子(結(jié)構(gòu)、大小、構(gòu)型和構(gòu)象)，金屬離子檢測(cè)及納米粒子等的表征分析；還可用于分析監(jiān)測(cè)特定生化反應(yīng)的過(guò)程和作為相關(guān)生化反應(yīng)的載體和媒介；甚至是疾病診斷的生物標(biāo)志物的分析鑒定。[5,6,7,8]   
1、核酸堿基序列的測(cè)定
生物納米孔傳感器目前被大規(guī)模成功應(yīng)用的領(lǐng)域?yàn)榛�因測(cè)序。已有多款基于生物納米孔開(kāi)發(fā)的測(cè)序儀成功地實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化，并在基礎(chǔ)科研領(lǐng)域大放異彩，解決了很多科研難題。當(dāng)前基于生物納米孔的核酸測(cè)序技術(shù)主要有三個(gè)流派：納米孔直接鏈測(cè)序法、引入聚合酶和標(biāo)記修飾核苷酸的邊合成邊測(cè)序法以及外切酶測(cè)序法，這三種技術(shù)各有特點(diǎn)。
 
(1)納米孔直接鏈測(cè)序
其基本原理為核酸分子(DNA/RNA)經(jīng)接頭幫助到達(dá)納米孔附近，在解旋酶/馬達(dá)蛋白的解旋/控速下，單鏈通過(guò)生物納米孔的孔道；傳感器檢測(cè)到不同核苷酸通過(guò)所引起的電流變化的差異并將其轉(zhuǎn)換為電信號(hào)；再根據(jù)電信號(hào)變化的頻譜，應(yīng)用模型識(shí)別算法得到堿基類(lèi)型從而達(dá)到測(cè)序的目的(圖8)。[9,10]
 
該方法具有測(cè)序速度快、堿基修飾可分析、文庫(kù)構(gòu)建簡(jiǎn)單等特點(diǎn)。但由于納米孔的最窄縮頸部的長(zhǎng)度可容納多個(gè)核苷酸，這種結(jié)構(gòu)使得核酸單鏈分子通過(guò)納米孔時(shí)產(chǎn)生的阻斷電流信號(hào)是由多個(gè)核苷酸的整體阻斷效應(yīng)造成的，而非單個(gè)核苷酸的阻斷效應(yīng)造成的，并且較難從整體阻斷電流信息中清晰地得出單個(gè)堿基的阻斷電流信息，特別是檢測(cè)單一堿基連續(xù)多次重復(fù)的均聚物時(shí)，容易漏讀和多讀。  
(2)引入聚合酶和標(biāo)記修飾核苷酸的邊合成邊測(cè)序法
著名的遺傳學(xué)家George Church教授和基因測(cè)序技術(shù)專(zhuān)家Jing yue Ju教授等基于生物納米孔傳感器開(kāi)發(fā)出了一種新的DNA測(cè)序平臺(tái)，該平臺(tái)包含磷脂膜上由7個(gè)亞基形成了納米孔孔道，其中一個(gè)特定的亞基上通過(guò)肽鏈橋/小分子鏈結(jié)合了僅具有合成功能的DNA聚合酶，可以合成與待測(cè)模版鏈互補(bǔ)的DNA鏈。通過(guò)預(yù)先連接在模版鏈上的引物，聚合酶摻入互補(bǔ)的核苷酸(dNTP)，每一種核苷酸都攜帶了特定的標(biāo)記物(Tag)。當(dāng)聚合酶按照模板逐步合成時(shí)，標(biāo)記物依次被切割，在電場(chǎng)力和半封閉的空間通道引導(dǎo)的綜合作用下進(jìn)入到納米孔中引起特征電流的阻斷信號(hào)，從而達(dá)到表征核酸序列的目的(圖9)。[11,12]
 
該方法具有測(cè)序準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)。但由于引入了特種DNA聚合酶及堿基標(biāo)記物修飾的核苷酸，整個(gè)系統(tǒng)的復(fù)雜程度高，需要各個(gè)工作元器件精妙的配合才能夠?qū)崿F(xiàn)有效測(cè)序。  
(3)外切酶測(cè)序法
其基本原理為核酸單鏈在核酸外切酶的作用下，被依次剪切為單核苷酸，在電場(chǎng)力的作用下，待檢測(cè)單個(gè)核苷酸通過(guò)納米孔時(shí)引起的電流變化，根據(jù)不同種類(lèi)堿基通過(guò)納米孔時(shí)產(chǎn)生的特征弱離子流信號(hào)，即可讀出每條單鏈DNA上的序列信息。由于單個(gè)核苷酸通過(guò)納米孔的速度極快，且造成的阻斷電流信號(hào)極小，單個(gè)核苷酸之間引起的電流阻斷的差異極其微弱，目前還無(wú)法有效地用于區(qū)分核苷酸的種類(lèi)，阻礙了外切酶-納米孔測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。
 
2、核酸堿基修飾的測(cè)定
DNA的堿基修飾（包括5-mC、5-hmC、5-fC、5-caC、4-mC和6-mA等）在個(gè)體發(fā)育、衰老和癌癥的篩查和診斷中發(fā)揮了重要功能。這些修飾并不干擾Watson-Crick配對(duì)原則，但能調(diào)控基因的開(kāi)關(guān)。與DNA類(lèi)似，RNA也具有多種修飾(真核生物常見(jiàn)為6-mA)，并且這些修飾參與了mRNA的剪接和蛋白翻譯等各個(gè)方面。了解特定修飾在基因組或轉(zhuǎn)錄組上的精確定位是解析其生物學(xué)功能的關(guān)鍵。近年來(lái)利用高通量測(cè)序鑒定DNA/RNA修飾位點(diǎn)的技術(shù)極大地助力了表觀基因組學(xué)和表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究。DNA甲基化檢測(cè)的方法有很多種，但大多離不開(kāi)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化。亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化是將序列中未甲基化的胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏ぃ║），而甲基化的胞嘧啶保持不變。然而，重亞硫酸鹽處理會(huì)導(dǎo)致DNA的降解，限制了在稀少珍貴樣品中的應(yīng)用。另外，由于占基因組95%的未甲基化C轉(zhuǎn)變成了T，降低了測(cè)序片段的匹配基因組的效率，也帶來(lái)了覆蓋度的偏好性。且該方法并不能區(qū)分5-mC和5-hmC，也無(wú)法識(shí)別其他類(lèi)型的堿基修飾。反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增會(huì)導(dǎo)致RNA堿基的修飾信息丟失，因此無(wú)法通過(guò)二代測(cè)序平臺(tái)來(lái)直接分析鑒別RNA上的堿基修飾情況。必須依靠抗體免疫沉淀或化學(xué)修飾可以實(shí)現(xiàn)全轉(zhuǎn)錄組RNA修飾圖譜繪制。但這些方法可檢測(cè)的修飾種類(lèi)有限，且通常只針對(duì)一種特定的修飾，仍有大量 RNA 修飾無(wú)法被檢測(cè)或被定位。目前大量的研究顯示，基于生物納米孔分析計(jì)劃，可以高效地識(shí)別DNA和RNA上的多種類(lèi)型的堿基修飾。
 
(1)DNA堿基修飾的識(shí)別
生物納米孔測(cè)序技術(shù)能夠檢測(cè)核酸分子自身的物理化學(xué)特性，與未被修飾的核苷酸相比，被修飾的相同核苷酸通過(guò)納米孔時(shí)對(duì)電流產(chǎn)生的電流阻斷信號(hào)會(huì)發(fā)生特異性的改變，因此基因組上的修飾信息能被電流阻斷信號(hào)表達(dá)。研究表明，帶有甲基化修飾的核苷酸和不帶修飾的相同核苷酸通過(guò)納米孔時(shí)會(huì)產(chǎn)生不同的電信號(hào)特征，因此通過(guò)深度學(xué)習(xí)模型捕獲甲基化修飾分子的特殊電信號(hào)模式可以發(fā)展出基于生物納米孔測(cè)序信號(hào)的DNA分子甲基化修飾檢測(cè)工具(圖10A)。可以進(jìn)行長(zhǎng)片段的讀取，并且具有直接獲取DNA修飾(無(wú)需化學(xué)或抗體處理)，具有重要意義。[13,14]  
(2)RNA堿基修飾的識(shí)別
通過(guò)基于生物納米孔的技術(shù)，在不經(jīng)反轉(zhuǎn)錄、無(wú)需擴(kuò)增的條件下即可直接讀取 RNA 上的所有堿基修飾信息，極大的提高了RNA堿基修飾識(shí)別的效率(圖10B)。Huanle等借助納米孔測(cè)序平臺(tái)對(duì)RNA進(jìn)行直接測(cè)序，高精度地檢測(cè)出N6-甲基腺苷(m6A) RNA修飾，準(zhǔn)確率達(dá)90%。該結(jié)果通過(guò)直接RNA測(cè)序鑒定RNA修飾的概念驗(yàn)證，并為將來(lái)探索其他RNA修飾提供借鑒，為研究RNA修飾在其天然RNA環(huán)境中的生物學(xué)作用開(kāi)辟了新途徑。[15]
 
南京大學(xué)黃碩教授團(tuán)構(gòu)建了一種高分辨的恥垢分枝桿菌膜蛋白A(MspA)納米孔，可以準(zhǔn)確識(shí)別所有的經(jīng)典核苷酸和它們的主要修飾，實(shí)現(xiàn)了高達(dá)7種常見(jiàn)修飾核苷酸的同時(shí)檢測(cè)，包括5-甲基胞苷(m5C)、N6 -甲基腺苷(m6A)、N7-甲基鳥(niǎo)苷(m7G)、N1-甲基腺苷(m1A)、肌苷(I)、假尿嘧啶(Ψ)和二氫尿嘧啶(D)。為直接檢測(cè) RNA 上的修飾，該團(tuán)隊(duì)利用核酸外切酶將天然 RNA 消化成單核苷酸，然后使用高分辨納米孔檢測(cè)和機(jī)器學(xué)習(xí)分析，獲得消化產(chǎn)物中核苷酸的組成和豐度，最終重構(gòu)出原始 RNA 的序列組成和修飾信息，為直接鑒定 RNA 中的表觀遺傳學(xué)修飾提供了快速方便的單分子分析方法(圖11)。[16]  
生物納米孔傳感器小結(jié)與展望
生物納米孔分析技術(shù)作為一種新穎的單分子分析手段，已廣泛應(yīng)用于單分子水平上DNA、RNA、多肽、蛋白質(zhì)、代謝產(chǎn)物的分析和表征，且不斷拓寬新的應(yīng)用邊界。越來(lái)越多的科研及臨床工作者致力于將單分子納米孔分析技術(shù)應(yīng)用到基礎(chǔ)科學(xué)研究和疾病的臨床診斷中，并取得了很多優(yōu)異的成果。隨著生物納米孔檢測(cè)技術(shù)和平臺(tái)的不斷提升和完善，并與其它傳感技術(shù)交叉融合，必將極大地推動(dòng)基礎(chǔ)科研和精準(zhǔn)醫(yī)療的快速發(fā)展。
 
但也能發(fā)現(xiàn)，生物納米孔技術(shù)在實(shí)際樣品檢測(cè)、數(shù)據(jù)處理和檢測(cè)裝置等方面還存在著一些不夠完美之處，這些問(wèn)題都一定程度限制了生物納米孔分析技術(shù)從科學(xué)研究到實(shí)際應(yīng)用的快速轉(zhuǎn)化和推廣。例如：
生物納米孔自身的靈敏度和選擇性仍有待進(jìn)一步提高，需通過(guò)基因工程技術(shù)不斷定相優(yōu)化納米孔自身的特性。
生物納米孔分析技術(shù)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量龐大、信號(hào)形態(tài)復(fù)雜、處理過(guò)程繁瑣、耗時(shí)等，需要不斷提升信號(hào)分析的算法和算力的綜合性能，才能準(zhǔn)確解讀這些數(shù)據(jù)信息。
高時(shí)間分辨、高電流分辨的生物納米孔匹配的信號(hào)采集和處理器發(fā)展較慢，納米孔生物傳感分析技術(shù)所能達(dá)到的時(shí)間分辨率、電流分辨不但與生物納米孔自身的特性有關(guān)，也與其匹配的信號(hào)采集和處理器的性能直接相關(guān)，需要進(jìn)一步提升這些傳感器的性能，才能整體提升生物納米孔傳感器的綜合性能。
 
現(xiàn)階段，單分子基因測(cè)序是生物納米孔傳感領(lǐng)域內(nèi)最重要的應(yīng)用，隨著納米孔測(cè)序技術(shù)產(chǎn)業(yè)化逐步展開(kāi)和升級(jí)，人們對(duì)超高通量納米孔測(cè)序（100萬(wàn)個(gè)孔道及以上）的需求愈發(fā)迫切，因此亟待發(fā)展一種新型的納米孔檢測(cè)模式，在降低檢測(cè)成本的同時(shí)能夠突破現(xiàn)有檢測(cè)通量的局限。
 
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