無機(jī)磷檢測(cè)試劑盒(米吐爾鉬藍(lán)比色法)使用說明書

 
血清中的無機(jī)磷(Inorganic phosphorous)主要由HzPO4和HPO2兩種磷酸根陰離子組成，上述陰離子在不同的pH環(huán)境下能快速相互轉(zhuǎn)換。在pH7.4血清中兩種磷酸根陰離子濃度比例為1:4,在酸中毒環(huán)境下二者濃度約為1:1,在堿中毒環(huán)境下二者濃度比例為1:9,在pH4.5尿液中濃度比例為100:1。WHO推薦的常規(guī)檢測(cè)方法為比色法，我國(guó)衛(wèi)生部臨檢中心推薦的常規(guī)方法為硫酸亞鐵鉬藍(lán)比色法和米吐爾鉬藍(lán)比色法。

無機(jī)磷檢測(cè)試劑盒(米吐爾鉬藍(lán)比色法)利用無機(jī)磷在酸性條件下與鉬酸銨結(jié)合生成磷鉬酸銨，后者被米吐爾還原成藍(lán)紫色的復(fù)合物，通過分光光度計(jì)測(cè)定650nm處吸光度，根據(jù)公式計(jì)算出無機(jī)磷含量。
本試劑盒僅用于科研，不宜用于臨床診斷或其他用途。
 
無機(jī)磷檢測(cè)試劑盒(米吐爾鉬藍(lán)比色法)產(chǎn)品組成：

名稱	100T	Storage
試劑(A):磷標(biāo)準(zhǔn)(1mg/ml)	1ml	4℃
試劑(B):標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液	5ml	4℃避光
試劑(C):Pi Assay Buffer	220ml	RT
試劑(D):米吐爾	4x0.35g	RT
試劑(E):ddH2O	2ml	RT
試劑(F):Pi去蛋白試劑（選做）	100ml	4℃避光

 
自備材料：
1、離心管或試管
2、水浴鍋或恒溫箱
3、比色杯
4、分光光度計(jì)
 
操作步驟(僅供參考)：
1、(選做)制備樣品:
①血漿、血清樣品:血漿、血清按照常規(guī)方法制備,可以直接用于本試劑盒的測(cè)定，-20℃凍存，用于Pi的檢測(cè)。
②細(xì)胞或組織樣品:取恰當(dāng)細(xì)胞或組織進(jìn)行勻漿，低速離心取上清，-20°℃凍存，用于Pi的檢測(cè)。
③高濃度樣品:如果樣品中含有較高濃度的Pi，可以蒸餾水稀釋。
④(選做)樣品準(zhǔn)備完畢后可以用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，以便于后續(xù)計(jì)算單位蛋白重量組織或細(xì)胞內(nèi)的Pi含量。
2、配制磷標(biāo)準(zhǔn)工作液:取適量的磷標(biāo)準(zhǔn)(1mg/ml)，按磷標(biāo)準(zhǔn)(1mg/ml):標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液=1:24的比例稀釋，即獲得磷標(biāo)準(zhǔn)工作液(1.292mmol/L)，-20C凍存，用于Pi的檢測(cè)。
3、配制米吐爾鉬藍(lán)顯色工作液:取1支0.35g的米吐爾，充分溶解于50ml Pi Assay Buffer，即為米吐爾鉬藍(lán)顯色工作液。4℃避光保存，一般建議3天內(nèi)用完。
4、Pi加樣:按照下表設(shè)置空白管、標(biāo)準(zhǔn)管、測(cè)定管，溶液應(yīng)按照順序依次加入，并注意避免產(chǎn)生氣泡，小心混勻。如果樣品中的無機(jī)磷濃度過高，可以減少樣品用量或適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測(cè)定，樣品的檢測(cè)最好能設(shè)置⒉平行管，求平均值。

加入物（μl）	空白管	標(biāo)準(zhǔn)管	測(cè)定管
ddH2O	0.05	-	-
磷標(biāo)準(zhǔn)工作液	-	0.05	-
待測(cè)樣本	-	-	0.05
米吐爾鉬藍(lán)顯色工作液	2.0	2.0	2.0

5、Pi測(cè)定:混勻，37°C孵育10min，比色杯光徑1.0cm，以空白調(diào)零，分光光度計(jì)650nm處測(cè)定，讀取各管吸光度(即為A_{標(biāo)準(zhǔn)}，A_測(cè)定)。

計(jì)算:
血清、血漿中無機(jī)磷計(jì)算公式:磷(mmol/L)=(A_測(cè)定/A_{標(biāo)準(zhǔn)})×1.292
組織中磷計(jì)算公式:磷(mmol/mg)=(A_測(cè)定/A_{標(biāo)準(zhǔn)})×1.292/待測(cè)樣品蛋白濃度(mg/L)
式中:
A_測(cè)定=待測(cè)管的吸光度
A_{標(biāo)準(zhǔn)}=標(biāo)準(zhǔn)管的吸光度
N=尿液稀釋倍數(shù)
單位換算:mg/dl=mmol/L/0.323
 
參考區(qū)間∶
健康成年人血清磷濃度:0.96~1.62mmol/L(3~5mg/dl)
兒童血清磷濃度:1.45~2.1mmol/L(4.5~6.5mg/dl)
 
注意事項(xiàng)∶
1、米吐爾鉬藍(lán)顯色工作液配制后，盡快使用，放置過久會(huì)導(dǎo)致正常血清液產(chǎn)生輕度渾濁。
2、如果樣品濃度過高，應(yīng)用蒸餾水稀釋后重測(cè)，結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)。
 
有效期:12個(gè)月有效。常溫運(yùn)輸，4℃保存。

附錄1:利用本法檢測(cè)血清白蛋白比值倒置的樣品時(shí)，易導(dǎo)致渾濁，可對(duì)樣品進(jìn)行取蛋白處理。操作如下:取0.1ml待測(cè)血清，加入0.9ml Pi去蛋白試劑，充分混勻，低速離心，取上清液0.05ml。磷標(biāo)準(zhǔn)工作液(1.292mmol/L)同樣進(jìn)行處理，其余同上述操作。