單細胞測序揭示心梗后巨噬細胞異質(zhì)性的空動力學和Trem2的功能

心力衰竭(HF)是心肌梗死(MI)的常見后果。通過鑒別MI后不同階段炎癥細胞的組成可能為建立新的生物標志物和治療方法提供線索。本研究通過單細胞RNA測序(scRNA-seq)和空間轉(zhuǎn)錄組學相結(jié)合，探索MI小鼠模型中與心肌梗死相關(guān)的免疫細胞時空動態(tài)。通過scRNA-seq鑒定出12個主要的免疫細胞群，并且這些細胞群的比例在MI后發(fā)生動態(tài)改變。其中巨噬細胞是最豐富的群體（>為60%，除心肌梗死后第1天外）。通過軌跡分析發(fā)現(xiàn)，心肌梗死后晚期巨噬細胞中Trem2的表達上調(diào)，體內(nèi)注射可溶性Trem2可顯著改善梗死心臟的功能和結(jié)構(gòu)。本研究有助于更好地理解心肌梗死驅(qū)動的免疫反應(yīng)，并且通過進一步研究Trem2信號通路的調(diào)控因子，將有利于探索心肌梗死后心衰的新治療策略。

 

文章題目：Spatiotemporal dynamics of macrophage heterogeneity and a potential function of Trem2hi macrophages in infarcted hearts

中文題目：單細胞測序--揭示心肌梗死中巨噬細胞異質(zhì)性的時空動力學和Trem2hi巨噬細胞的潛在功能

發(fā)表日期：2022.08

期刊名稱：Nature communications

影響因子：17.694

實驗平臺：10x Chromium 單細胞轉(zhuǎn)錄組測序、10x Genomics 空間轉(zhuǎn)錄組學

DOI：10.1038/s41467-022-32284-2.

 

研究內(nèi)容

• 心肌梗死后的免疫細胞動力學研究

為了獲得心臟缺血損傷后免疫細胞圖譜，研究者分別在MI后第1、3、5和7天通過流式細胞術(shù)分離小鼠CD45+白細胞（梗死和梗死周圍區(qū)域）并進行scRNA-seq測序。將處于穩(wěn)態(tài)（MI前）的CD45+細胞作為對照。所有時間點共捕獲33977個細胞，聚類注釋后得到12個的細胞簇(cluster)。其中最豐富的細胞群是巨噬細胞。在MI前，巨噬細胞占比最高，但在MI后第1天急劇下降，從MI后第3天開始恢復(fù)，在MI后第7天達到峰值。相反，中性粒細胞的比例在第1天增加，然后迅速下降。一些其他細胞類型也呈時間依賴性變化，例如，單核細胞在MI早期（第1天和第3天）增加，在MI晚期（第5天和第7天）減少；淋巴細胞(T細胞、B細胞、NK細胞和ILC2細胞)在MI第1天下降，直到MI后第7天才達到穩(wěn)定值。單細胞測序數(shù)據(jù)表明，不同的細胞群在心肌梗死后的隨時間動態(tài)變化具有差異。

 

• 心肌梗死后免疫細胞的時空分布

為了驗證上述浸潤到梗死區(qū)域的免疫細胞，研究者對心肌梗死后第1、3、5和7天的冷凍樣本進行空間轉(zhuǎn)錄組測序（ST-seq），在每個樣本中確定4-5個細胞簇。接下來進一步研究每個spot中的細胞類型組成。結(jié)果顯示，中性粒細胞在MI后第1天高度浸潤到梗死區(qū)域，但隨后數(shù)量迅速減少（在MI第3、5和7天）；巨噬細胞從MI后第3天開始浸潤到梗死區(qū)域，其豐度在心肌梗死晚期達到高峰（MI后第5天和第7天）；單核細胞和成纖維細胞也以時間依賴性的方式浸潤心臟梗死區(qū)域；其他免疫細胞群（如B和T細胞群）豐度非常低，分散在整個小鼠心臟（不聚集在梗死區(qū)域）。MI后不同時間點的ST-seq與scRNA-seq數(shù)據(jù)相結(jié)合，結(jié)果說明心肌梗死早期單核細胞和中性粒細胞浸潤到梗死區(qū)域，而巨噬細胞和成纖維細胞的作用相反。

 

• 心肌梗死后單核細胞和巨噬細胞的異質(zhì)性及其時間動態(tài)改變

scRNA-seq結(jié)果顯示，巨噬細胞是心臟中最大的免疫細胞群體。為了進一步了解MI后巨噬細胞亞型的動態(tài)變化，研究者進行了亞聚類分析，共獲得了16個亞細胞群。其中3個巨噬細胞亞簇（簇1、3和13）在MI前細胞占比高，研究者將其命名為穩(wěn)態(tài)巨噬細胞(SS-Mφ)簇。差異基因分析顯示，SS-Mφ1（簇3）中，Lyve1、F13a1等巨噬細胞相關(guān)基因的表達升高；SS-Mφ2簇（簇1）顯示出相對較高的抗原呈遞相關(guān)基因的表達；在SS-Mφ3簇（簇13）中均檢測到SS-Mφ1和SS-Mφ2的標記基因，表明這些細胞處于介于SS-Mφ1和SS-Mφ2簇之間的中間狀態(tài)。在MI早期階段（第1和3天），單核細胞和兩個巨噬細胞簇細胞在單核/巨噬細胞總數(shù)中占比高（簇4、10和14），稱為Early-Mφ簇。在MI晚期（第5和7天），4個巨噬細胞簇占比高（SS-Mφ1、SS-Mφ2、簇2和簇5），稱為Late-Mφ簇；此外，研究者還發(fā)現(xiàn)了3個巨噬細胞群體，2個富含干擾素刺激基因的巨噬細胞群體，以及2個增殖群體（比例較低），這些細胞群在簇6和簇15中富集，表達許多與干擾素信號相關(guān)的基因，如Irf7、Isg15和Ifit2，因此被定義為IFN-Mφ。以上亞聚類分析揭示了巨噬細胞的異質(zhì)性，以及巨噬細胞/單核細胞的時間動態(tài)改變，Late-Mφ和SS-Mφ簇可能在減弱心肌梗死后的炎癥反應(yīng)和促進組織修復(fù)方面具有重要功能。

 

• 梗死心臟的單細胞運動軌跡

為了更好地了解單核/巨噬細胞浸潤到梗死區(qū)域的過程，研究者使用Monocle R包進行軌跡分析。結(jié)果顯示，以Ly6c2hi單核細胞為根時，細胞按Early-Mφ、Transient-Mφ和Late-Mφ的順序增加。然而，Transient-Mφ1和IFN-Mφ種群在相對較早的時間內(nèi)發(fā)生了分化，而Transient-Mφ1與Late-Mφ沒有聯(lián)系。接下來研究每個細胞群中特異性表達的基因隨時間的變化。結(jié)果顯示：Early-Mφ特異性基因在Ly6c2hi monocytes/Early-Mφ中表達上調(diào)，然后在Transient-Mφ中逐漸降低，在Late-Mφ細胞中達到低水平。相反，Late-Mφ特異性基因在Ly6c2himonocytes/Early-Mφ中下調(diào)，然后在瞬時Mφ和Late-Mφ細胞中逐漸上調(diào)。值得注意的是，在梗死的心臟組織中使用ST-seq檢查基因的表達以及巨噬細胞亞群的比例時發(fā)現(xiàn)，每個亞群的標記基因和比例以時間依賴性的方式富集在心臟梗死區(qū)域，而SSMφ1細胞在心肌梗死后的所有時間點都分散在心臟中。

 

• 中性粒細胞和樹突狀細胞亞群

中性粒細胞是MI后第一天內(nèi)最大的細胞群，接下來進一步鑒定5個不同的中性粒細胞亞簇（圖4a），研究不同階段中性粒細胞和DC細胞占比及基因改變。結(jié)果顯示，MI前cluster 1和cluster 3占比高，而在MI后第1天cluster 3的比例明顯下降，在MI后第7天逐漸增加，MI后cluster 1沒有明顯變化的趨勢。相反，MI前cluster 2的占比較少，但在MI后第1天顯著增加，并在第3天達到峰值。cluster 4高表達與干擾素信號相關(guān)的基因，Hspa5、Dnajb9f和Hyou1等上調(diào)。對于DC細胞，鑒定出6個不同的亞簇，其中cluster 2、3和4在MI死前占比高，但在MI后第5天比例逐漸下降。cluster 4表現(xiàn)出明顯的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，高表達Xcr1和Clec9a；cluster 6中漿細胞樣DC標記基因的上調(diào)。

 

• 心肌梗死后Trem2的表達

先前的研究表明，在動脈粥樣硬化進展過程中，小鼠心臟中Trem2的表達增加。在本研究中，免疫組化顯示，MI后梗死區(qū)Trem2的表達逐漸增加。WB結(jié)果顯示，full-lengthTrem2的表達量逐漸增加，在MI后第5天達到峰值；而solubleTrem2 (sTrem2)在MI后第3天后增加，并在第7天達到峰值。接下來，通過共定位實驗，驗證Trem2hi巨噬細胞是否是MI后Trem2表達模式的主要細胞群。結(jié)果顯示，Trem2信號與CD68+信號共定位（CD68+巨噬細胞在梗死區(qū)域明顯增加），說明Trem2過表達主要發(fā)生在巨噬細胞中。此外，研究者還評估了MI后第3天和第5天，在 Trem2hi and Trem2low細胞中sTrem2的分泌水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)sTrem2僅在Trem2hi巨噬細胞中分泌，并且sTrem2水平在MI第5天明顯高于第3天。這些結(jié)果表明Trem2在梗死心臟的巨噬細胞中高表達，而sTrem2只由Trem2hi巨噬細胞分泌。

 

• MI后期Trem2hi巨噬細胞在損傷心臟中發(fā)揮抗炎作用

接下來通過流式細胞數(shù)術(shù)分離心肌梗死小鼠模型中Trem2巨噬細胞的主要亞群進行鑒定，包括MI早期和晚期的Ccr2hi和Trem2hi巨噬細胞。結(jié)果顯示，Ccr2hi巨噬細胞的比例在MI后第1天迅速增加，然后逐漸下降，說明巨噬細胞被招募到梗死區(qū)域（與scRNA-seq數(shù)據(jù)分析一致）。Trem2hi巨噬細胞的比例在MI后第3天開始增加，在第5天達到峰值，說明Trem2h主要在MI晚期發(fā)揮功能。Ccr2hi和Trem2hi巨噬細胞亞群基因分析結(jié)果顯示Ccr2hi巨噬細胞促炎因子相關(guān)基因的表達更高，而Trem2hi巨噬細胞則表達更高水平的抗炎因子相關(guān)基因。以上結(jié)果表明，Trem2hi細胞可能具有抗炎巨噬細胞的特性。這些數(shù)據(jù)表明Trem2hi巨噬細胞在心肌梗死晚期占主導地位，并具有抗炎特性。

• 體內(nèi)注射可溶性soluble Trem2后左心室重構(gòu)明顯改善

為了驗證sTrem2對心肌梗死后重構(gòu)的影響，研究者向MI小鼠注射sTrem2，與對照組MI小鼠比較。結(jié)果顯示，sTrem2組小鼠MI后28天左心室射血分數(shù)(LVEF)、縮短分數(shù)(FS)和收縮末期容積(ESV)顯著降低；左室擴張和重構(gòu)良好，梗死壁更厚，纖維化更低；sTrem2組小鼠的梗死面積明顯小于對照組小鼠，存活率明顯增加�？傊�，這些結(jié)果表明，sTrem2在體內(nèi)促進了梗死心臟的功能和結(jié)構(gòu)的改善。

 

主要結(jié)論

本研究探索巨噬細胞異質(zhì)性的時空動態(tài)及Trem2hi巨噬細胞在心臟組織修復(fù)中的潛在功能，繪制了MI后梗死心臟的一個全面的單細胞和空間轉(zhuǎn)錄組圖譜。對目前理解心肌梗死驅(qū)動的免疫反應(yīng)做出了重要貢獻，并且對與Trem2信號通路調(diào)控因子的深入研究將有助于建立心肌梗死后心衰的新治療策略。

 

四. 參考文獻

Jung SH, Hwang BH, Shin S, et al. Spatiotemporal dynamics of macrophage heterogeneity and a potential function of Trem2himacrophages in infarcted hearts. Nat Commun. 2022;13(1):4580. Published 2022 Aug 6.