壞死性凋亡的分子機制和在腫瘤免疫中的作用

   

細胞死亡可分為兩種模式：調節(jié)性細胞死亡 (RCD) 和意外細胞死亡 (ACD)。具有代表性的 RCD 是細胞凋亡，細胞凋亡 (apoptosis) 是指為維持內環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞自主的有序的死亡 (見推文: 細胞凋亡——如何檢測？速戳!)，相反，非生理刺激，如物理、機械和化學應力等外界因素誘導的被動和非程序性的壞死 (necrosis) 是 ACD 的代表。 

 

壞死性凋亡 (necroptosis) 綜合了兩者 (壞死和凋亡) 的特點，期間，可以觀察到細胞器腫脹、細胞膜破裂，細胞質和細胞核的分解等形態(tài)學變化，是一種受到調控的細胞壞死過程，又被稱為程序性壞死。

 

   
 

不同于凋亡過程，壞死性凋亡的調控過程不依賴于 Caspase 活性，其基本分子機制由兩種受體相互作用蛋白激酶 (RIPK1 和 RIPK3) 和混合譜系激酶結構域樣假激酶 (MLKL) 組成。RIPK3 調控 MLKL 磷酸化，誘導其寡聚化，易位至質膜并在質膜上產生孔復合體，導致 DAMPs (damage associated molecular patterns) 的分泌、細胞腫脹和膜破裂。

 

圖 1. 壞死性凋亡機制圖^[1]

 
   

研究認為：腫瘤細胞發(fā)生壞死是為其增殖和轉移創(chuàng)造有利環(huán)境的自我犧牲策略，但壞死性凋亡在大多數(shù)情況下發(fā)揮腫瘤抑制作用。2016 年，Aaes 等人首次確認腫瘤中的壞死性凋亡是一種免疫原性細胞死亡。在 Vaccination with Necroptotic Cancer Cells Induces Efficient Anti-tumor Immunity 一文中，Aaes 等人將發(fā)生壞死性凋亡的腫瘤細胞制成預防性疫苗提前注射給小鼠，發(fā)現(xiàn)預防性疫苗的預處理抑制了小鼠的腫瘤生長，這表明發(fā)生壞死性凋亡的腫瘤細胞本身具有免疫原性，可刺激適應性免疫系統(tǒng)。Aaes 等人還指出，發(fā)生壞死性凋亡的腫瘤細胞可誘導樹突狀細胞的成熟、細胞毒性 T 細胞的交叉啟動以及 IFN-γ 的產生。

 

 

2021 年 8 月 21 日，來自韓國的 You-Sun Kim 團隊，在 Molecular Cancer 上發(fā)表了題為 RIPK3 activation induces TRIM28 derepression in cancer cells and enhances the anti-tumor microenvironment 的研究性論文，研究人員采用 TAP-MS 方法，結合 RNA 測序 (RNA-Seq) 數(shù)據(jù)集分析，確定了 TRIM28 是在壞死性凋亡過程中調節(jié)轉錄活性的共抑制因子�；罨�的 RIPK3 磷酸化 TRIM28，抑制TRIM28 的染色質結合活性，從而促進 NF-κB 和其他轉錄因子 (如 SOX9) 的反式激活。這些最終導致細胞因子表達升高，然后增強免疫調節(jié)過程，例如樹突狀細胞成熟等�？傊�，RIPK3 的表達與各種腫瘤類型的腫瘤浸潤性免疫細胞群呈顯著正相關，從而激活抗腫瘤免疫反應。

 

 

圖 2. RIPK3/TRIM28 激活介導免疫刺激細胞因子的產生^[2]

 

 

2022 年 5 月 25 日，腫瘤免疫領域又有了關于壞死性凋亡的新發(fā)現(xiàn)。在 Nature 雜志發(fā)表的題為 ADAR1 masks the cancer immunotherapeutic promise of ZBP1-driven necroptosis 的論文中，研究指出，DNA 的右旋狀態(tài) (B-DNA)是生物體中存在的最常見的狀態(tài)，在特殊情況下，B-DNA 翻轉形成“畸形”的左旋狀態(tài)，即 Z-DNA。ADAR1 (RNA 腺苷脫氨酶1) 和 ZBP1 (Z-DNA 結合蛋白) 都可特異性識別 Z-DNA 并與之結合。ADAR1 通過抑制免疫原性雙鏈 RNA (dsRNA) 來阻斷免疫檢查點抑制劑 (ICB) 的作用，而 ZBP1 可驅動腫瘤細胞發(fā)生壞死性凋亡。

 

CBL0137 可觸發(fā)細胞中左旋 Z-DNA 的形成，激活癌癥相關成纖維細胞中的 ZBP1 依賴性壞死性凋亡途徑。CBL0137 在癌癥相關的成纖維細胞中誘導 ZBP1 依賴的壞死性凋亡，并且無論導致癌癥的突變如何，CBL0137 都可殺死支持腫瘤生長的成纖維細胞，并在黑色素瘤的小鼠模型中逆轉了 ICB 的無反應性。

 

圖 3. CBL0137 誘導 ZBP1 依賴的壞死性凋亡^[4]

CBL0137 激活 ZBP1 依賴的細胞核壞死性凋亡：通過誘導 Z-DNA 累積進而觸發(fā)了 ZBP1、RIPK3 和 MLKL 之間的反應。 

 

 

 

壞死性凋亡的檢測，關鍵的挑戰(zhàn)在于將它與凋亡和壞死區(qū)分開。很多情況下，凋亡、壞死、壞死性凋亡等不同的死亡方式會同時存在于細胞群中。因此，細胞死亡的檢測要輔以實時的形態(tài)分析以及死亡通路的抑制或敲除。同時，找對采樣的時間點也很關鍵。

 

■ 形態(tài)變化

細胞死亡的形態(tài)變化是一個動態(tài)變化的過程，因此，需要實時“監(jiān)控”整個過程才能確認壞死性凋亡的發(fā)生。延時視頻顯微鏡能夠將單個細胞的形態(tài)變化與分子、亞細胞和生化事件相關聯(lián)，從而檢測壞死性凋亡 (但此方法成本較高且比較耗費人力)。

 

■ 抑制和敲除

壞死性凋亡的抑制劑——RIPK1 抑制劑 Necrostatin-1 和 MLKL 抑制劑 Necrosulfonamide 來阻斷壞死性凋亡，測定細胞的存活率，反向驗證壞死性凋亡的發(fā)生。但是抑制劑能在某些細胞中誘導細胞凋亡，在區(qū)分壞死性凋亡和凋亡方面不夠特異。因此，需要通過敲除關鍵蛋白 (如 RIPK3 或 MLKL 阻斷壞死性凋亡)，補充抑制實驗的證據(jù)。

 

■ 關鍵蛋白質檢測

用 Western blot、免疫組化或流式細胞儀來檢測壞死性凋亡途徑中的關鍵蛋白質如 RIPK3、RIPK1 和 MLKL 的變化。磷酸化 MLKL (Ser358 和 Thr357) 是最常見的檢測蛋白，可確認壞死性凋亡是通過 RIPK3 介導的 MLKL 激活。此外，高比例的 RIPK1/ pro-caspase-8 的高比例也說明了環(huán)境有利于壞死性凋亡。

 

圖 4. 細胞死亡檢測一般流程^[5]

 

■ 關鍵蛋白質檢測

在癌癥中，壞死性凋亡主要發(fā)生在晚期腫瘤的中心，壞死細胞分散。在不通過顯微解剖富集的情況下，很難檢測到關鍵蛋白標記物。Baik 等人在 Examining MLKL phosphorylation to detect necroptosis in murine mammary tumors 一文提供了一種詳細的免疫組織化學導向的方法，包括從小鼠乳腺腫瘤模型中分離腫瘤、通過 H＆E 染色識別壞死區(qū)域以及檢測磷酸化 MLKL 來檢測壞死性凋亡；該方法也可用于其它類型的實體瘤。

 

圖 5. 檢測小鼠腫瘤組織的壞死性凋亡^[6]

 

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參考文獻

1. Galluzzi L, Kepp O, Chan FK, Kroemer G. Necroptosis: Mechanisms and Relevance to Disease. Annu Rev Pathol. 2017 Jan 24;12:103-130.

2. Aaes TL, Kaczmarek A, Delvaeye T, et al. Vaccination with Necroptotic Cancer Cells Induces Efficient Anti-tumor Immunity. Cell Rep. 2016 Apr 12;15(2):274-87.

3. Park HH, Kim HR, Park SY, et al. RIPK3 activation induces TRIM28 derepression in cancer cells and enhances the anti-tumor microenvironment. Mol Cancer. 2021 Aug 21;20(1):107.
4. Zhang T, Yin C, Fedorov A, et al. ADAR1 masks the cancer immunotherapeutic promise of ZBP1-driven necroptosis. Nature. 2022 Jun;606(7914):594-602.
5. ‍‍‍‍‍‍‍‍‍Chapter · February 2014. Methods to Study and Distinguish Necroptosis. DOI: 10.1007/978-1-4614-8220-8_18

6. Baik JY, Wan P, Liu ZG. Examining MLKL phosphorylation to detect necroptosis in murine mammary tumors. STAR Protoc. 2022 Jun 14;3(3):101457.