外泌體純化的基本步驟和常用方法

2013年諾貝爾獎(jiǎng)中，美國(guó)科學(xué)家詹姆斯·羅斯曼等三人發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞的囊泡運(yùn)輸調(diào)控機(jī)制，外泌體是囊泡的其中一種。

外泌體(exosomes)是一種能被機(jī)體內(nèi)大多數(shù)細(xì)胞分泌的微小膜泡，具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)，直徑大約為30-150nm(頭發(fā)絲的1/1000)。

外泌體廣泛存在并分布于各種體液中，攜帶和傳遞重要的信號(hào)分子，形成了一種全新的細(xì)胞-細(xì)胞間信息傳遞系統(tǒng)，影響細(xì)胞的生理狀態(tài)并與多種疾病的發(fā)生與進(jìn)程密切相關(guān)。

其主要來(lái)源于細(xì)胞內(nèi)溶酶體微粒內(nèi)陷形成的多囊泡體，經(jīng)多囊泡體外膜與細(xì)胞膜融合后釋放到胞外基質(zhì)中。

干細(xì)胞分泌的外泌體，可以通過(guò)囊泡，將干細(xì)胞的精華部分，打包運(yùn)輸出干細(xì)胞體外，從而參與各種細(xì)胞活動(dòng)。

臍帶是干細(xì)胞的豐富來(lái)源。一條人的臍帶可以產(chǎn)生估計(jì)數(shù)量為1000萬(wàn)的華通氏膠（Wharton’s jelly）來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞。傳至第6代，使用3D培養(yǎng)和TFF可生產(chǎn)為6×10^13個(gè)外泌體。對(duì)于臨床前小動(dòng)物研究，每只小鼠用10^9-10^11個(gè)外泌體進(jìn)行計(jì)算，一條臍帶可以提供足夠的外泌體來(lái)治療600-60,000只小鼠。因此，大規(guī)模動(dòng)物研究可能由來(lái)自單個(gè)臍帶分離的低代數(shù)（6代以下）間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體來(lái)生產(chǎn)。

干細(xì)胞外泌體如何獲得：
1. 細(xì)胞培養(yǎng)：首先需要培養(yǎng)產(chǎn)生外泌體的細(xì)胞，比如肝細(xì)胞、肺細(xì)胞、腎細(xì)胞、干細(xì)胞等。根據(jù)不同的細(xì)胞類型，需要采用不同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。
2. 細(xì)胞收集：當(dāng)細(xì)胞達(dá)到一定密度后，可以將其收集下來(lái)。如果需要純化外泌體，建議使用低血清或無(wú)血清培養(yǎng)基，以避免血清蛋白對(duì)外泌體的干擾。
3. 離心：將細(xì)胞培養(yǎng)物離心，去除細(xì)胞碎片和大顆粒物質(zhì)。通常建議使用低速離心（例如300×g）和高速離心（例如10,000×g）進(jìn)行兩次離心，以確保去除雜質(zhì)。
4. 超速離心：將上述離心液用超速離心（例如100,000×g）離心，收集上清液，此時(shí)上清液中應(yīng)當(dāng)含有外泌體。
5. 洗滌：用PBS等緩沖液洗滌上清液，去除殘留的蛋白和雜質(zhì)。
6. 再次離心：將洗滌后的上清液再次進(jìn)行超速離心（例如100,000×g），去除雜質(zhì)和殘留緩沖液。
7. 外泌體收集：將上述離心液中的沉淀物收集下來(lái)，即為外泌體。





檢測(cè)外泌體，以下是幾種常用的方法：
電子顯微鏡（EM）：EM是檢測(cè)外泌體最直接的方法之一。使用EM可以觀察到外泌體的形態(tài)和大小，但無(wú)法獲得外泌體內(nèi)部的詳細(xì)信息。
免疫印跡（Western blot）：Western blot是檢測(cè)外泌體中特定蛋白的一種方法。首先需要使用抗體識(shí)別外泌體中的蛋白，然后使用化學(xué)發(fā)光或染色方法檢測(cè)抗體結(jié)合的蛋白。
流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry）：流式細(xì)胞術(shù)可以檢測(cè)外泌體的大小和數(shù)量。首先需要將外泌體標(biāo)記上熒光染料，然后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光信號(hào)。
納米粒子追蹤技術(shù)（nanoparticle tracking analysis）：納米粒子追蹤技術(shù)可以用于檢測(cè)外泌體的大小和數(shù)量。該技術(shù)使用激光追蹤納米粒子的運(yùn)動(dòng)軌跡，從而推斷出外泌體的大小和濃度。

上述方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，具體應(yīng)用時(shí)需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的方法進(jìn)行檢測(cè)。

大規(guī)模培養(yǎng)干細(xì)胞需要用到的耗材：
. 10L|20L耐高溫高壓儲(chǔ)液桶
. 100mm|150mm細(xì)胞培養(yǎng)皿
. 250ml|500ml|1000ml方形試劑瓶
. T150|T175|T225細(xì)胞培養(yǎng)瓶、五層細(xì)胞培養(yǎng)瓶
. COP西林瓶
. 1、2、5、10層細(xì)胞工廠
. 250ml|500ml大容量錐形離心管
. 凍存管及其他常規(guī)耗材
. 各規(guī)格杯式濾器