細胞活力檢測方法大盤點及CTG 發(fā)光法的應用案例

 

常用的細胞活力檢測試劑主要有 MTT、CCK8 等檢測方法 (圖 1)。

MTT法：又稱 MTT 比色法。其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性 MTT 還原為不溶于水的藍紫色結晶甲臜 (Formazan) 并沉積在細胞中，但死細胞無此功能，后經 DMSO 溶解，于 490 nm 處測定吸光值便可間接反應細胞活力。但該方法除去操作步驟耗時以外，生成的 Formazan 是不溶于水的，需經 DMSO 溶解后才能檢測，增加了工作量的同時仍不能保證測定結果的準確性，且該溶劑對人體具有明顯毒性。

CCK8法：相較于 MTT，無論是操作步驟還是檢測時間都優(yōu)化了很多。CCK8 是一種基于 WST-8 而廣泛應用于細胞增殖和細胞毒性的快速、高靈敏度、無放射性的比色檢測方法(可看往期推文 CCK-8，讓細胞活性檢測 So Easy!)。但在實驗時，一直有個問題讓人很困擾——“細胞增殖越多越快，則顏色越深；細胞毒性越大，則顏色越淺”，但這個顏色深淺的標準我 “標” 不出來怎么辦？痛點！痛點！痛點！

 
 

 科研汪 ：MTT 作為“元老”級別的檢測方法，雖然“老練”，Paper 無數，但麻煩是真麻煩，CCK8 法倒是便捷很多！

 小 M：那你是還沒用過更便捷的...

 科研汪 ：莫非你說的是細胞活力檢測的“金標準”？

 小 M：CTG 細胞活力檢測，簡單、靈敏、快速的均質檢測方法，反應 10 分鐘即可得到“Bling Bling”的檢測結果，你就說“快不快”？

 

CTG 發(fā)光法：基于高靈敏度生物發(fā)光檢測技術，通過對三磷酸腺苷 (ATP) 進行定量以測定培養(yǎng)物中活細胞數目及細胞活力。該實驗方法可用三個字簡單概括 “快、準、狠”，比 MTT 的處理速度快近 20 倍，節(jié)省時間近 4 小時。CTG 特有的均質檢測法即 “加樣-混樣-檢測”，使用時，只需將本試劑等體積添加至培養(yǎng)細胞中即可進行檢測。不用感慨，細胞活力檢測為什么不能如此簡單？

 

 

圖 1. MTT、CCK8 與 CTG 法的實驗流程圖

 
表 1. MTT、CCK8 與 CTG 法特點比較
 

 
首先，來了解實驗 CTG 發(fā)光法的測定原理：ATP 作為細胞新陳代謝的一個重要指標，與活細胞數目呈良好的線性關系，是細胞活力檢測的重要標志性分子。
ATP 生物發(fā)光的原理為：熒光素酶以熒光素、ATP 和 O₂ 為底物，在 Mg²⁺ 存在時，可將化學能轉化為光能；在熒光素酶催化的發(fā)光反應中，ATP 在一定的濃度范圍內，其濃度與發(fā)光強度呈線性關系，即在光信號與酶反應體系中，發(fā)光值與 ATP 呈正比，ATP 與活細胞數成正比，CTG 發(fā)光法通過 ATP 含量來進行細胞計數或活力測定，且不受化合物自發(fā)熒光的影響 (圖 2)，是細胞增殖測定，細胞活力測定和細胞毒性高通量篩選分析的理想選擇。

圖 2. CTG 法檢測原理 

■ 案例 1：細胞增殖測定

如圖 3 所示，為了探究 SIPL1 對 TNBC 細胞增殖的影響，將 SIPL1 表達載體轉染至 BT-549 與 MDA-MB-231 細胞， 并使用 CCK8 法與 CTG 法，進行細胞增殖檢測。
 

CCK-8 檢測：TNBC 細胞瞬時轉染 shRNA 或過表達質粒并培養(yǎng) 24 h 后檢測。

CTG 發(fā)光細胞活力測定：TNBC 細胞在 37°C 下培養(yǎng)過夜。然后，將 100 µL CTG 溶液直接與培養(yǎng)基混合，在室溫下培養(yǎng) 20 分鐘。結果顯示，轉染靶向 SIPL1 shRNAs 的 BT-549 和 MDA-MB-231 細胞系的細胞增殖顯著降低 (圖 3)。

圖 3. SIPL1 對 TNBC 細胞活力的影響^[1]

CCK-8 (a) 和 CTG 發(fā)光細胞活力測定 (b) 用指示載體轉導 BT-549 和

MDA-MB-231 細胞增殖能力的分析。

 

■ 案例 2：細胞活力測定

如圖 4 所示，為了探究外源 RRM2 是否會影響肝癌細胞的鐵死亡，在 HepG2 和 SMMC-7721 細胞中過表達或敲除 RRM2，通過 CTG 法檢測其對細胞活力的影響。結果表明，過表達 RRM2 時，細胞活力明顯增強，反之，敲除 RRM2 時，細胞活力明顯降低^[1]。

 

 

圖 4. 通過 CTG 法測定 RRM2 對細胞活力的影響^[2]

(a) 在體外表達或敲除 RRM2 的 HepG2 和 SMMC-7721 細胞中測量細胞死亡 (b) 和 4-HNE 水平 (c)，然后再用 Fer-1、ZVAD-FMK、Nec-1 或體外表達的 RRM2 進行進一步處理。細胞活力測定采用 CTG 發(fā)光細胞活力測定法。

 

■ 案例 3：細胞毒性高通量篩選分析

如下圖所示，作者團隊報告了一種基于濃度-反應曲線的表型定量高通量篩選 (qHTS)，旨在識別對瘧原蟲肝臟和無性血期寄生蟲具有活性的化合物 (圖 5)。使用 SYBR Green 或熒光素酶來測試對寄生蟲生長的抑制，共檢測了 456,817 種化合物。

在 qHTS 之后，又分類選擇了 4,253 種合成易處理的化合物，用于驗證抗瘧原蟲活性和哺乳動物毒性。在 3 μM 和 1 μM 濃度下對化合物進行體外抗伯氏瘧原蟲肝期寄生蟲的評估。其中使用 CTG 法評估了所有 4,253 種化合物對 HepG2 的細胞毒性。其中 255 種化合物對 HepG2 細胞表現出一定程度的生長細胞毒性，AC₅₀ 值 < 43 µM (隨后被排除)。最終篩選出 994 種經過驗證的無毒性化合物，用于針對肝階段寄生蟲的后續(xù)評估。

圖 5. 針對惡性瘧原蟲無性血期寄生蟲的定量高通量篩選^[3]。

   



   

對比測試結果表明：持續(xù) 3 h 的生物發(fā)光穩(wěn)定性的檢測中，MCE CTG Cell Viability Detection Reagent 的發(fā)光信號值比較穩(wěn)定 (圖 5a)；不同細胞數的線性范圍中，MCE 產品線性關系良好，與進口 競品線性幾乎一致 (圖 5b)；且對于不同細胞系，MCE 產品與進口競品檢測信號值相當 (圖 5c)。綜上檢測結果表明，MCE CTG 試劑盒可實現穩(wěn)定、靈敏、批次間差異較小的不同細胞系的細胞活力檢測。

表 2. MCE CTG Cell Viability Detection Reagent 產品特性

靠譜的細胞活力 CTG 檢測試劑，尊貴的 VIP 客戶體驗，想發(fā) SCI 深夢囈語的心。無需按捺您的“蠢蠢欲動”，小 M 早已備好你想要的試用裝 (試用裝鏈接)。體驗不收費，時間最寶貴~ 快快申領吧！

實驗小 Tips，附上 CTG 使用注意事項，希望你能早日發(fā) SCI 啦。

1. 熒光素酶的活性對溫度較為敏感，反復凍融會致其逐漸失活，建議分裝凍存，避免反復凍融。凍融時，可能會導致試劑中出現少量沉淀，可平衡至室溫后觀測沉淀溶解情況，如仍有殘留，可離心后去除。
2. 本產品在使用或分裝時所使用耗材應注意避免 ATP 污染。
3. 若待測藥物的溶劑含量較高，熒光素酶反應可能會被干擾，致化學發(fā)光信號受到影響，可設置含有溶劑的細胞培養(yǎng)液的對照孔以排除此干擾。
4. 檢測時需使用適合于細胞培養(yǎng)的白色或黑色的多孔板 (96 孔板或 384 孔板)，普通透明多孔板的相鄰孔之間可能會產生相互干擾。如使用透明板，可使用不透明的白色膠帶粘貼孔底。
5. 建議在避光環(huán)境下進行熒光檢測。
6. 由于整個發(fā)光反應非常迅速，建議加入 CTG 試劑孵育 10 分鐘后，立即檢測熒光。

 

相關產品

Cell Counting Kit-8 Cell Counting Kit-8，簡稱 CCK-8 試劑盒或 CCK8 試劑盒，是一種基于 WST-8 而廣泛應用于細胞活性和細胞毒性檢測的快速、高靈敏度試劑盒。

CTG Cell Viability Detection Reagent MCE CTG 發(fā)光法細胞活力檢測試劑盒基于高靈敏度生物發(fā)光檢測技術，通過對 ATP 進行定量以測定培養(yǎng)物中活細胞數目及細胞活力。

Cytotoxicity LDH Assay Kit MCE LDH Assay Kit 是通過分析釋放到培養(yǎng)上清液中的 LDH 活性而測定細胞損傷的試劑盒。配合使用 CCK-8 (Cat.: No. HY-K0301) 可獲得死細胞、活細胞數據。

MCE 的所有產品僅用作科學研究或藥證申報，我們不為任何個人用途提供產品和服務
 

參考文獻

 
1. Juanjuan He, Jing Wang, et al. SIPL1, Regulated by MAZ, Promotes Tumor Progression and Predicts Poor Survival in Human Triple-Negative Breast Cancer. Front Oncol. 2021 Dec 17;11:766790.   
 
2. Yueyue Yang, Jiafei Lin, Susu Guo, et al. RRM2 protects against ferroptosis and is a tumor biomarker for liver cancer. Cancer Cell Int. 2020 Dec 7;20(1):587.
 
3. Dorjbal Dorjsuren, Richard T Eastman, et al. Chemoprotective antimalarials identified through quantitative high-throughput screening of Plasmodium blood and liver stage parasites.Sci Rep. 2021 Jan 22;11(1):2121. 

點擊化學：https://www.medchemexpress.cn/click-chemistry.html