內皮細胞共培養(yǎng)利于人慢性粒細胞白血病干細胞和祖細胞的體外維持
慢性粒細胞白血�。–ML）是一種骨髓增殖性疾病，表現為成熟和未成熟的粒細胞不受調控的異常增殖，導致外周血白細胞大量增生。CML起源于白血病干細胞（LSC，CD34+CD38-lin-cells）群體。LSCs存在于骨髓微環(huán)境（BMM）中，與正常的造血干細胞（HSCs）共存。在疾病進展過程中，HSCs被LSCs及其子代取代。研究已經表明，白血病細胞會改變其周圍的生態(tài)位，例如，通過誘導促炎環(huán)境，為LSC的自我更新、分化和存活創(chuàng)造寬松的空間。
血管微環(huán)境已被確定為CML發(fā)展的重要因素。在小鼠模型中觀察到，惡性腫瘤建立后骨髓（BM）中血管化增加，在CML患者的BM 中同樣，這提示其與預后不良有關。據報道，在CML小鼠模型中，BM內皮細胞可以調節(jié)白血病干細胞和祖細胞的靜息和增殖。然而，這一觀察結果尚未在原代人類細胞中得到評估。
在墨西哥國立自治大學、墨西哥塞古羅社會研究所的一項報告中，描述了原始白血病細胞與內皮集落形成細胞（ECFC）的共培養(yǎng)，作為白血病細胞與血管微環(huán)境相互作用的體外模型，以分析內皮細胞對維持CML患者干細胞和祖細胞的影響。
與內皮細胞共培養(yǎng)可維持原始 CML 細胞
基于血管微環(huán)境能夠調節(jié)小鼠惡性造血的事實，實驗建立了一個體外模型，其中人內皮細胞（EC）與富含干細胞和祖細胞（認為是原始細胞）的CML細胞群共培養(yǎng)。如圖1 a，CML細胞與EC的共培養(yǎng)對CML細胞有維持作用。在沒有EC（對照）的情況下沒有觀察到這種效果。值得注意的是，當在沒有內皮細胞但存在造血刺激因子（細胞因子對照）的情況下培養(yǎng)細胞時，CML細胞群的總數量翻了一番。
內皮細胞與CML細胞共培養(yǎng)，不接觸或接觸，都導致Lin-CD34+ CD38- 細胞水平分別比初始細胞數增加110%和170%（圖1 b）。后者與細胞因子對照中的增加相似。在對照培養(yǎng)（僅基礎培養(yǎng)基）中，Lin-CD34+ CD38- 細胞的數量減少（圖1 b）。在Lin-CD34+ CD38+ 細胞中，當它們與EC接觸時觀察到增加了 20%。這種增加在細胞因子對照培養(yǎng)中沒有發(fā)生，并且與陰性對照和無接觸共培養(yǎng)相比具有統(tǒng)計學意義，其中細胞群的總數量減少了一半（圖1 c）。
為了確定共培養(yǎng)對集落形成細胞（CFC）水平的影響，進行了集落測定。圖1 d顯示當白血病細胞與EC接觸時，CFC水平得以維持；相比之下，在無接觸共培養(yǎng)中，CFC水平降低了50%。在細胞因子對照和僅基礎培養(yǎng)基對照中，CFC數量分別減少了65%和83%（圖1 d）。此外，在無接觸共培養(yǎng)中，觀察到大多數集落對應于骨髓（CFU-G和CFU-M）和晚期紅系（CFU-E）集落，而在接觸共培養(yǎng)中，觀察到高比例的BFU-E，CFU GM和CFU-Mix集落，這表明直接接觸共培養(yǎng)有利于更原始祖細胞的存活。
為了鑒定可能參與培養(yǎng)中白血病細胞維持的可溶性因子，在培養(yǎng)3天后對上清液進行了多重分析。在無接觸共培養(yǎng)中，發(fā)現與骨髓分化相關的炎性細胞因子和可溶性分子的大量產生。另一方面，在直接接觸培養(yǎng)中，炎癥分子的分泌減少，僅觀察到高水平的IL-1a，IL-6和SCF（圖1 e）。值得注意的是，所有這些細胞因子都參與CML細胞維持。這些數據表明，與內皮細胞的接觸有利于維持培養(yǎng)中的CML原始細胞。
白血病干細胞仍然附著在內皮細胞上
基于上述結果，表明內皮細胞和CML原始細胞之間直接接觸的重要性，因此接下來專注于直接接觸共培養(yǎng)。實驗觀察到，在共培養(yǎng)3天后，檢測到兩種不同的造血細胞：一部分由直接附著在內皮上的造血細胞（cc貼壁）組成，占總細胞的15.9%，第二部分留在共培養(yǎng)的上清液中（cc非貼壁），占細胞的84%（圖2 a、b）。有趣的是，這些比例在正常造血細胞的培養(yǎng)中有很大的不同（圖2 a），其中附著在內皮上的細胞數量較多（40.2%）。
當在每個共培養(yǎng)組中分析細胞免疫表型時，以不同的頻率檢測到干細胞、祖細胞和成熟細胞（圖2 c、d）。在貼壁部分中，16%，61% 和 22% 分別顯示干細胞，祖細胞和成熟細胞免疫表型。在非貼壁部分中，具有干細胞，祖細胞和成熟細胞免疫表型的細胞百分比分別為9%，74% 和17%。值得注意的是，Lin-CD34+ CD38+ 細胞的增加與評估的CFC數量相關（圖2 e）。
考慮到CD26已被作為是 CML干細胞的特異性標志物，因此在共培養(yǎng)的總造血細胞以及直接接觸共培養(yǎng)物的貼壁和非貼壁組中評估了其表達。圖2 f顯示，在EC存在3天和6天后，lin-CD34+ CD38- CD26+ 細胞的水平分別增加50%和120%。與這一結果一致的是，3天后在附著和非附著到內皮的細胞中檢測到CD26的表達（圖2 g），而成熟細胞的數量（CD34- Lin+，圖2 d）和骨髓細胞（CD14+，圖2 h）細胞減少。
當使用MEG-01 CML細胞系（人成巨核細胞白血病細胞系）時，也觀察到了類似的結果。事實上，干細胞群優(yōu)先富集貼壁部分（從0時的0.25% 到共培養(yǎng)3天后的1.34%）。這些結果表明，在培養(yǎng)系統(tǒng)中，分化和未分化的CML細胞可能對內皮細胞具有不同的親和力。
與EC共培養(yǎng)可調控CML LSC的增殖狀態(tài)
為了確定EC在CML增殖和干細胞免疫表型保留中的作用，在24、48和72 h用CFSE多重染色跟蹤CML 細胞（CD45+）和干細胞（CD34+ CD38-）群，并在EC存在下共培養(yǎng)3天后跟蹤原始免疫表型標記。
圖3表明，在MEG-01細胞系的總CML群中，保持附著在EC上的部分具有最高的增殖潛力（圖3 a，紅色直方圖），與細胞分裂指數的顯著增高相關（圖3 b）。在原代CML細胞總群中觀察到相同的結果（圖3 d，紅色直方圖和3 e），但在正常骨髓細胞中未檢測到，其中貼壁和非貼壁細胞顯示出相似的增殖，也具有相似的細胞分裂指數。
當跟蹤來自MEG-01細胞系（CD34+ CD38-）和一個CML原代樣品（lin-CD34+ CD38-）的干細胞群時，相對于非貼壁細胞，粘附在內皮層的部分觀察到更多的細胞分裂（圖3 a、d）。這種增殖能力比之前描述的CML細胞總數更明顯。與這一結果一致，MEG-01細胞的貼壁部分的細胞分裂指數高于非貼壁部分的干細胞（圖3 c）。此外，在保持粘附于EC上的CML原代細胞樣品中，具有干細胞和祖細胞免疫表型的細胞總數相對于CML對照中的初始數量增加了4倍和1.7倍（圖3 f、g）。這些結果表明，白血病干細胞具有在內皮微環(huán)境中保留和增殖的特殊能力，即使它們存在于貼壁部分中。
為了驗證與EC接觸的Lin-CD34+ CD38- 的增殖能力，在每次共培養(yǎng)結束時評估細胞周期狀態(tài)。結果表明，與EC接觸72 h后，G0期貼壁細胞數量相對于0時增加5倍，而S/G2/M期數量減少。相反，非貼壁部分的細胞增殖期（S/G2/M）增加（圖3 h、i）。這些結果與正常骨髓細胞的結果不同，其中靜息細胞群在共培養(yǎng)前后保持相似，表明這種行為是CML細胞獨有的，并且取決于細胞接觸。
有趣的是，G0 期粘附在EC上的細胞中有29.5% 顯示出干細胞表型，相比之下，非粘附部分中只有 2.7% 的G0細胞顯示出干細胞表型（圖3 j）。此外，在活躍的細胞周期階段（S/G2/M）未觀察到具有干細胞表型的細胞，其中最高百分比（90%）對應于祖細胞（圖3 j）。
這些結果表明，內皮微環(huán)境可以誘導CML干細胞的增殖和/或靜息，這可能與兩個細胞系之間建立的相互作用類型有關。
與EC共培養(yǎng)后改變細胞因子譜和Notch 表達
為了解釋白血病細胞在內皮微環(huán)境中的持久性，在共培養(yǎng)3天后分析了它們的細胞因子譜。圖4 a表明，與對照（無接觸共培養(yǎng)）相比，可溶性因子（例如：IL-1a，IL-6和PIGF）顯著增加，這些因子與白血病有關，以犧牲正常的造血能力為代價。可能引發(fā)慢性炎癥并引起促白血病微環(huán)境的分子，如IL-8、TGF-b1、GM-CSF和MCP-1，也顯著升高。這種情況可能與觀察到的增殖有關，但不一定能解釋細胞的靜息。
考慮到在小鼠模型中粘附分子（如Notch1及其配體）參與CML干細胞和祖細胞的維持，因此實驗分析了共培養(yǎng)組、MEG-01細胞系和內皮細胞中Notch1、Jagged 2 和DLL4的表達。結果發(fā)現，共培養(yǎng)72小時后，白血病細胞和內皮細胞中Notch-1和 Jagged-2 表達增加（圖4 b）。該時間點（72小時）與細胞周期G0期白血病細胞停滯的時刻相關，盡管肯定還有其他分子參與其中，但這項研究的結果表明，在人類CML中，內皮微環(huán)境為維持白血病造血創(chuàng)造了合適的場所，并且干細胞的靜息和增殖，即使在粘附條件下，也可能與通過直接接觸和可溶性因子分泌物建立的通訊有關，這會導致白血病的持久性。
總之，這項研究表明，原始CML細胞和正常內皮細胞之間的共培養(yǎng)，沒有任何額外因素的情況下，產生了一個微環(huán)境，通過它們的靜息狀態(tài)、增殖和分化，允許原始CML細胞在體外的維持，這似乎與炎癥環(huán)境的產生有關，以及它們自身的粘附能力，可能涉及 Notch1-Jagged2 軸。在這種情況下，有必要使用源自CML骨髓的內皮細胞來評估這些相同的生物效應，其中觀察到的效果可能更大，因為內皮細胞可能已經具有功能改變。
參考文獻：Torres-Barrera P, Moreno-Lorenzana D, Alvarado-Moreno JA, García-Ruiz E, Lagunas C, Mayani H, Chávez-González A. Cell Contact with Endothelial Cells Favors the In Vitro Maintenance of Human Chronic Myeloid Leukemia Stem and Progenitor Cells. Int J Mol Sci. 2022 Sep 7;23(18):10326. doi: 10.3390/ijms231810326. PMID: 36142235; PMCID: PMC9499491.
小編旨在分享、學習、交流生物科學等領域的研究進展。如有侵權或引文不當請聯(lián)系小編修正。
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血管微環(huán)境已被確定為CML發(fā)展的重要因素。在小鼠模型中觀察到，惡性腫瘤建立后骨髓（BM）中血管化增加，在CML患者的BM 中同樣，這提示其與預后不良有關。據報道，在CML小鼠模型中，BM內皮細胞可以調節(jié)白血病干細胞和祖細胞的靜息和增殖。然而，這一觀察結果尚未在原代人類細胞中得到評估。
在墨西哥國立自治大學、墨西哥塞古羅社會研究所的一項報告中，描述了原始白血病細胞與內皮集落形成細胞（ECFC）的共培養(yǎng)，作為白血病細胞與血管微環(huán)境相互作用的體外模型，以分析內皮細胞對維持CML患者干細胞和祖細胞的影響。
與內皮細胞共培養(yǎng)可維持原始 CML 細胞
基于血管微環(huán)境能夠調節(jié)小鼠惡性造血的事實，實驗建立了一個體外模型，其中人內皮細胞（EC）與富含干細胞和祖細胞（認為是原始細胞）的CML細胞群共培養(yǎng)。如圖1 a，CML細胞與EC的共培養(yǎng)對CML細胞有維持作用。在沒有EC（對照）的情況下沒有觀察到這種效果。值得注意的是，當在沒有內皮細胞但存在造血刺激因子（細胞因子對照）的情況下培養(yǎng)細胞時，CML細胞群的總數量翻了一番。
內皮細胞與CML細胞共培養(yǎng)，不接觸或接觸，都導致Lin-CD34+ CD38- 細胞水平分別比初始細胞數增加110%和170%（圖1 b）。后者與細胞因子對照中的增加相似。在對照培養(yǎng)（僅基礎培養(yǎng)基）中，Lin-CD34+ CD38- 細胞的數量減少（圖1 b）。在Lin-CD34+ CD38+ 細胞中，當它們與EC接觸時觀察到增加了 20%。這種增加在細胞因子對照培養(yǎng)中沒有發(fā)生，并且與陰性對照和無接觸共培養(yǎng)相比具有統(tǒng)計學意義，其中細胞群的總數量減少了一半（圖1 c）。
為了確定共培養(yǎng)對集落形成細胞（CFC）水平的影響，進行了集落測定。圖1 d顯示當白血病細胞與EC接觸時，CFC水平得以維持；相比之下，在無接觸共培養(yǎng)中，CFC水平降低了50%。在細胞因子對照和僅基礎培養(yǎng)基對照中，CFC數量分別減少了65%和83%（圖1 d）。此外，在無接觸共培養(yǎng)中，觀察到大多數集落對應于骨髓（CFU-G和CFU-M）和晚期紅系（CFU-E）集落，而在接觸共培養(yǎng)中，觀察到高比例的BFU-E，CFU GM和CFU-Mix集落，這表明直接接觸共培養(yǎng)有利于更原始祖細胞的存活。
為了鑒定可能參與培養(yǎng)中白血病細胞維持的可溶性因子，在培養(yǎng)3天后對上清液進行了多重分析。在無接觸共培養(yǎng)中，發(fā)現與骨髓分化相關的炎性細胞因子和可溶性分子的大量產生。另一方面，在直接接觸培養(yǎng)中，炎癥分子的分泌減少，僅觀察到高水平的IL-1a，IL-6和SCF（圖1 e）。值得注意的是，所有這些細胞因子都參與CML細胞維持。這些數據表明，與內皮細胞的接觸有利于維持培養(yǎng)中的CML原始細胞。
圖1 與內皮細胞共培養(yǎng)可維持CML原始細胞。
（A）在EC共培養(yǎng)三天后評估總CML細胞數。（B）共培養(yǎng)3天后評估干細胞（Lin-CD34+ CD38-）或（C）祖細胞（Lin-CD34 + CD38 +）細胞數。（D）共培養(yǎng)三天后，將3000個造血細胞在甲基纖維素中傳代培養(yǎng)14天，并評估CFC。（E）通過多重分析物測定進行細胞因子檢測。白血病干細胞仍然附著在內皮細胞上
基于上述結果，表明內皮細胞和CML原始細胞之間直接接觸的重要性，因此接下來專注于直接接觸共培養(yǎng)。實驗觀察到，在共培養(yǎng)3天后，檢測到兩種不同的造血細胞：一部分由直接附著在內皮上的造血細胞（cc貼壁）組成，占總細胞的15.9%，第二部分留在共培養(yǎng)的上清液中（cc非貼壁），占細胞的84%（圖2 a、b）。有趣的是，這些比例在正常造血細胞的培養(yǎng)中有很大的不同（圖2 a），其中附著在內皮上的細胞數量較多（40.2%）。
當在每個共培養(yǎng)組中分析細胞免疫表型時，以不同的頻率檢測到干細胞、祖細胞和成熟細胞（圖2 c、d）。在貼壁部分中，16%，61% 和 22% 分別顯示干細胞，祖細胞和成熟細胞免疫表型。在非貼壁部分中，具有干細胞，祖細胞和成熟細胞免疫表型的細胞百分比分別為9%，74% 和17%。值得注意的是，Lin-CD34+ CD38+ 細胞的增加與評估的CFC數量相關（圖2 e）。
考慮到CD26已被作為是 CML干細胞的特異性標志物，因此在共培養(yǎng)的總造血細胞以及直接接觸共培養(yǎng)物的貼壁和非貼壁組中評估了其表達。圖2 f顯示，在EC存在3天和6天后，lin-CD34+ CD38- CD26+ 細胞的水平分別增加50%和120%。與這一結果一致的是，3天后在附著和非附著到內皮的細胞中檢測到CD26的表達（圖2 g），而成熟細胞的數量（CD34- Lin+，圖2 d）和骨髓細胞（CD14+，圖2 h）細胞減少。
當使用MEG-01 CML細胞系（人成巨核細胞白血病細胞系）時，也觀察到了類似的結果。事實上，干細胞群優(yōu)先富集貼壁部分（從0時的0.25% 到共培養(yǎng)3天后的1.34%）。這些結果表明，在培養(yǎng)系統(tǒng)中，分化和未分化的CML細胞可能對內皮細胞具有不同的親和力。
圖2 CML原始細胞對內皮微環(huán)境具有不同的親和力。
（A）CML和NBM接觸共培養(yǎng)中貼壁和非貼壁造血細胞的百分比。（B）與貼壁（右）和非貼壁（左）細胞組共培養(yǎng)的代表性照片。（C）代表性點圖和（D）在實驗開始（零時間）和三天后不接觸（對照）或存在EC時，分別分析貼壁和非貼壁部分部分的不同CML種群的百分比。（E）共培養(yǎng)三天后，將3000個造血細胞在甲基纖維素中傳代培養(yǎng)14天并評估CFC。（F）CML干細胞CD26+ 在共培養(yǎng)3天和6天后進行評估，以及（G）貼壁和非貼壁部分。（H）CD14+ 髓系細胞的百分比。與EC共培養(yǎng)可調控CML LSC的增殖狀態(tài)
為了確定EC在CML增殖和干細胞免疫表型保留中的作用，在24、48和72 h用CFSE多重染色跟蹤CML 細胞（CD45+）和干細胞（CD34+ CD38-）群，并在EC存在下共培養(yǎng)3天后跟蹤原始免疫表型標記。
圖3表明，在MEG-01細胞系的總CML群中，保持附著在EC上的部分具有最高的增殖潛力（圖3 a，紅色直方圖），與細胞分裂指數的顯著增高相關（圖3 b）。在原代CML細胞總群中觀察到相同的結果（圖3 d，紅色直方圖和3 e），但在正常骨髓細胞中未檢測到，其中貼壁和非貼壁細胞顯示出相似的增殖，也具有相似的細胞分裂指數。
當跟蹤來自MEG-01細胞系（CD34+ CD38-）和一個CML原代樣品（lin-CD34+ CD38-）的干細胞群時，相對于非貼壁細胞，粘附在內皮層的部分觀察到更多的細胞分裂（圖3 a、d）。這種增殖能力比之前描述的CML細胞總數更明顯。與這一結果一致，MEG-01細胞的貼壁部分的細胞分裂指數高于非貼壁部分的干細胞（圖3 c）。此外，在保持粘附于EC上的CML原代細胞樣品中，具有干細胞和祖細胞免疫表型的細胞總數相對于CML對照中的初始數量增加了4倍和1.7倍（圖3 f、g）。這些結果表明，白血病干細胞具有在內皮微環(huán)境中保留和增殖的特殊能力，即使它們存在于貼壁部分中。
為了驗證與EC接觸的Lin-CD34+ CD38- 的增殖能力，在每次共培養(yǎng)結束時評估細胞周期狀態(tài)。結果表明，與EC接觸72 h后，G0期貼壁細胞數量相對于0時增加5倍，而S/G2/M期數量減少。相反，非貼壁部分的細胞增殖期（S/G2/M）增加（圖3 h、i）。這些結果與正常骨髓細胞的結果不同，其中靜息細胞群在共培養(yǎng)前后保持相似，表明這種行為是CML細胞獨有的，并且取決于細胞接觸。
有趣的是，G0 期粘附在EC上的細胞中有29.5% 顯示出干細胞表型，相比之下，非粘附部分中只有 2.7% 的G0細胞顯示出干細胞表型（圖3 j）。此外，在活躍的細胞周期階段（S/G2/M）未觀察到具有干細胞表型的細胞，其中最高百分比（90%）對應于祖細胞（圖3 j）。
這些結果表明，內皮微環(huán)境可以誘導CML干細胞的增殖和/或靜息，這可能與兩個細胞系之間建立的相互作用類型有關。
圖3 內皮微環(huán)境可以誘導CML干細胞的增殖和細胞周期停滯。
（A）來自MEG-01細胞系或（D）原代CML樣品的總或干細胞群中培養(yǎng)24，48和72小時的CFSE測定的代表性直方圖。MEG-01細胞系（B）群體和（C）干細胞群（CD38 + CD34-）在共培養(yǎng)24、48和72小時時的細胞分裂指數。（E）共培養(yǎng)3天后的原代CML總細胞。共培養(yǎng)72小時后具有（F）干細胞（Lin-CD34+ CD38-）和（G）祖細胞（Lin-CD34+ CD38 +）免疫表型的細胞數量。（H）在不同共培養(yǎng)條件3天后一個CML樣品的代表性點圖。（I）細胞周期階段的倍數變化。（J）每個共培養(yǎng)條件和細胞周期階段不同造血亞群的百分比。與EC共培養(yǎng)后改變細胞因子譜和Notch 表達
為了解釋白血病細胞在內皮微環(huán)境中的持久性，在共培養(yǎng)3天后分析了它們的細胞因子譜。圖4 a表明，與對照（無接觸共培養(yǎng)）相比，可溶性因子（例如：IL-1a，IL-6和PIGF）顯著增加，這些因子與白血病有關，以犧牲正常的造血能力為代價。可能引發(fā)慢性炎癥并引起促白血病微環(huán)境的分子，如IL-8、TGF-b1、GM-CSF和MCP-1，也顯著升高。這種情況可能與觀察到的增殖有關，但不一定能解釋細胞的靜息。
考慮到在小鼠模型中粘附分子（如Notch1及其配體）參與CML干細胞和祖細胞的維持，因此實驗分析了共培養(yǎng)組、MEG-01細胞系和內皮細胞中Notch1、Jagged 2 和DLL4的表達。結果發(fā)現，共培養(yǎng)72小時后，白血病細胞和內皮細胞中Notch-1和 Jagged-2 表達增加（圖4 b）。該時間點（72小時）與細胞周期G0期白血病細胞停滯的時刻相關，盡管肯定還有其他分子參與其中，但這項研究的結果表明，在人類CML中，內皮微環(huán)境為維持白血病造血創(chuàng)造了合適的場所，并且干細胞的靜息和增殖，即使在粘附條件下，也可能與通過直接接觸和可溶性因子分泌物建立的通訊有關，這會導致白血病的持久性。
圖4 與EC共培養(yǎng)后的細胞因子譜和notch 表達。
（A）共培養(yǎng)3天后評估共培養(yǎng)上清液中的細胞因子濃度。（B）采用流式細胞術分析共培養(yǎng)24、48和72h后內皮細胞和MEG-01細胞系中Notch1、Jagged-2 和DLL4的表達。總之，這項研究表明，原始CML細胞和正常內皮細胞之間的共培養(yǎng)，沒有任何額外因素的情況下，產生了一個微環(huán)境，通過它們的靜息狀態(tài)、增殖和分化，允許原始CML細胞在體外的維持，這似乎與炎癥環(huán)境的產生有關，以及它們自身的粘附能力，可能涉及 Notch1-Jagged2 軸。在這種情況下，有必要使用源自CML骨髓的內皮細胞來評估這些相同的生物效應，其中觀察到的效果可能更大，因為內皮細胞可能已經具有功能改變。
參考文獻：Torres-Barrera P, Moreno-Lorenzana D, Alvarado-Moreno JA, García-Ruiz E, Lagunas C, Mayani H, Chávez-González A. Cell Contact with Endothelial Cells Favors the In Vitro Maintenance of Human Chronic Myeloid Leukemia Stem and Progenitor Cells. Int J Mol Sci. 2022 Sep 7;23(18):10326. doi: 10.3390/ijms231810326. PMID: 36142235; PMCID: PMC9499491.
小編旨在分享、學習、交流生物科學等領域的研究進展。如有侵權或引文不當請聯(lián)系小編修正。
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