腸道類器官的應(yīng)用及設(shè)計(jì)思路

最近幾年，涉及轉(zhuǎn)運(yùn)體和受體的生理過(guò)程受到越來(lái)越多的關(guān)注，人們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)運(yùn)體在腸道中發(fā)揮著雙向功能(Zietek and Daniel,2015)。除了具有在吸收性腸上皮細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)功能，轉(zhuǎn)運(yùn)體還在分泌激素的內(nèi)分泌細(xì)胞的頂端膜扮演著感受器的作用(Gorboulev et al.,2012)，調(diào)控腸促胰島素釋放進(jìn)入血液(Diakogiannaki et al.,2013;Roder et al.,2014)。既往研究中，腸道受體也被證明具有類似的調(diào)節(jié)腸道激素分泌的功能( Reimann et al.,2012 )。腸促胰島素GLP-1和GIP具有促進(jìn)胰島素分泌的功能，對(duì)調(diào)節(jié)血糖水平至關(guān)重要。在腸內(nèi)分泌細(xì)胞中，轉(zhuǎn)運(yùn)體和受體作為傳感器，成為2型糖尿病療法開發(fā)中具有高度潛力的靶點(diǎn)(Gribble and Reimann,2016;Zictek andDaniel,2015)。

在腸上皮細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)、藥物的吸收功能和內(nèi)分泌細(xì)胞的激素分泌功能等方面(Petersen et al. ,2014;Schweinlinet al.,2016;Zietek et al., 2015 )。這些過(guò)程與營(yíng)養(yǎng)吸收障礙疾病、藥物檢測(cè)和代謝紊亂疾病(如肥胖或2型糖尿病)高度相關(guān)，由于腸道類器官可以呈現(xiàn)體內(nèi)組織結(jié)構(gòu)的重要特點(diǎn)，因此它成為高度分化的、功能健全的腸上皮細(xì)胞的良好來(lái)源。

除此之外，通過(guò)利用特定的調(diào)節(jié)因子如γ-分泌酶抑制劑，類器官還可富集腸道稀有細(xì)胞類型，如腸內(nèi)分泌細(xì)胞，其在正常生理?xiàng)l件下僅占腸上皮細(xì)胞的1%(Petersen et al.,2015)。以此為基礎(chǔ)的類器官培養(yǎng)將極大地促進(jìn)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)科學(xué)研究具有深遠(yuǎn)的影響。

研究證實(shí)，腸道類器官包含腸上皮的所有細(xì)胞類型(Sato et al.,2009;Spence et  al., 2011)，包括分泌GIP和GLP-1的腸內(nèi)分泌細(xì)胞( Petersen et al.,2014;Petersen et al. 2015)。類器官可來(lái)自小鼠或人的腸道組織，用標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)，并可在實(shí)驗(yàn)室通過(guò)傳代培養(yǎng)數(shù)月，因此，最近研究者在探究小鼠腸道類器官是否可以成為用于腸道轉(zhuǎn)運(yùn)、感知和激素分泌研究的體外模型(Zietek et al.,2015)，由于腸道營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)體特異性表達(dá)于膜的頂部或基底外側(cè)，因此類器官的上皮包含極化的腸上皮細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，許多營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)體，如SGLT1、PEPT1或GLUT5，均表達(dá)于面向腸腔的頂端膜，以從消化的食物中吸收營(yíng)養(yǎng)(Daniel and Zietek,2015)。然而，其他一些營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)體，如氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體或GLUT2，則表達(dá)于基底膜，從而介導(dǎo)來(lái)自腸上皮細(xì)胞的養(yǎng)分進(jìn)入血液循環(huán)(Roder et al. 2014)，因此，保證目的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白定位在腸道類器官的正確位置是非常重要的。

在研究特定激素分泌時(shí)，確保類器官培養(yǎng)中包含腸內(nèi)分泌細(xì)胞亦非常必要，最簡(jiǎn)便的方法便是將類器官包埋于石蠟中，進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)。在研究轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(或其它腸道蛋白)時(shí)，推薦利用缺乏目的蛋白表達(dá)的敲除小鼠進(jìn)行類器官培養(yǎng)來(lái)驗(yàn)證染色的特異性。根據(jù)不同的目的蛋白，在構(gòu)建類器官時(shí)選擇正確的部位較為關(guān)鍵，腸道部位與腸道激素分泌的研究也同樣相關(guān)，不同亞型的腸內(nèi)分泌細(xì)胞分布在腸道的不同部位。值得注意的是，從近端小腸到遠(yuǎn)端小腸，分離所得到的隱窩明顯減少，培養(yǎng)所得到的類器官也明顯減少。在研究營(yíng)養(yǎng)感知時(shí)，如果所研究的傳感器蛋白的表達(dá)位置與目標(biāo)腸內(nèi)分泌細(xì)胞亞型的分布位置不同則需要做出折中。

 

類器官用于腸道轉(zhuǎn)運(yùn)、感知、激素分泌示意圖
 

宿主-微生物相互作用是指微生物(如細(xì)菌、寄生蟲、病毒)與宿主(如人類、動(dòng)物)之間發(fā)生的相互作用，宿主-微生物相互作用的研究需要合適的模型系統(tǒng)來(lái)模擬體內(nèi)感染。在過(guò)去的幾十年里，研究者們采用了各種體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛠?lái)研究宿主與微生物的相互作用，這些模型的最終目的是在體外創(chuàng)建一個(gè)能夠模擬人體真實(shí)情況的環(huán)境，以闡明健康和疾病中宿主反應(yīng)的生理機(jī)制。這些模型包括來(lái)源于人或動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)系(Dingli and Nowak,2006)，可經(jīng)口或接種感染病原體的選定動(dòng)物模型(Fang et al.,2013)，以及模擬宿主-細(xì)菌相互作用的類器官(Fatehullah et al.,2016)。對(duì)于某些感染因子而言，目前完全缺乏良好的模型系統(tǒng)，而對(duì)于另一些感染因子，現(xiàn)有的模型也并非最佳。

非類器官方法及類器官方法在宿主-細(xì)菌相互作用研究中的優(yōu)缺點(diǎn)如下。

腸道上皮是成年哺乳動(dòng)物中自我更新速度最快的組織，它包括一系列分化的細(xì)胞類型，每個(gè)類型都有其自身的特性。大多數(shù)用于研究沙門菌和腸道上皮細(xì)胞之間相互作用的體外模型無(wú)法重現(xiàn)在正常腸道中觀察到的分化組織成分和結(jié)構(gòu)。創(chuàng)建分化細(xì)胞的一種方法是通過(guò)懸浮培養(yǎng)技術(shù)，該技術(shù)使用旋轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器使細(xì)胞保持懸浮并無(wú)氣泡通氣，以這種方式形成的三維(3D)聚合體的特征在于具有細(xì)胞極性、細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生和器官特異性分化。然而，該系統(tǒng)可能缺乏負(fù)責(zé)腸道組織更新的正常干細(xì)胞生態(tài)位(Zhang et al.,2014)。

新近發(fā)展起來(lái)的類器官模型充當(dāng)了體內(nèi)外系統(tǒng)之間的橋梁，Ootani等報(bào)道了一種復(fù)雜的培養(yǎng)體系，即在基質(zhì)細(xì)胞的支持下，將整個(gè)腸組織切片包埋在3D膠原結(jié)構(gòu)中(Ootani et al.,2009)。Sato及其同事建立了一個(gè)相對(duì)簡(jiǎn)單的類器官培養(yǎng)系統(tǒng)，使用基質(zhì)膠作為ECM替代品，并輔以構(gòu)成關(guān)鍵內(nèi)源性生態(tài)位信號(hào)的生長(zhǎng)因子。該系統(tǒng)已被用于創(chuàng)建具有明顯隱窩和絨毛樣結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)與中央管腔相鄰，其中包含從不斷更新的上皮層中擠出的死細(xì)胞(Sato et al.,2009)。類器官如實(shí)再現(xiàn)了體內(nèi)上皮結(jié)構(gòu)，并包含完整的干細(xì)胞、祖細(xì)胞和分化細(xì)胞類型(Fatehullah et al.,2016;Sato et al.,2009)。此后，腸道類器官被用于基礎(chǔ)和臨床研究的各個(gè)方面，包括用于產(chǎn)生人腸道類器官，以及用于從具有不同遺傳修飾的動(dòng)物模型中產(chǎn)生類器官。
 

設(shè)計(jì)思路

利用來(lái)源于隱窩的小鼠腸道類器官，研究者能夠直觀觀察鼠傷寒沙門菌的侵襲性以及類器官的形態(tài)變化(Zhang et al.,2014)。在類器官中，結(jié)構(gòu)域與中央管腔相鄰，中央管腔含有從不斷更新的上皮層擠出的死細(xì)胞，研究者利用致病性傷寒沙門菌14028S(10°CFU)定植感染培養(yǎng)物。第一個(gè)30min的孵育使細(xì)菌接觸到類器官細(xì)胞表面，30min后，用Hank's平衡鹽溶液(Hank's balanced salt solution,HBSS)洗去細(xì)胞外細(xì)菌。之后，將受感染的類器官在含有慶大霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)1h。研究人員發(fā)現(xiàn)細(xì)菌感染顯著抑制了類器官的生長(zhǎng)，包括出芽和類器官培養(yǎng)物的總面積。鼠傷寒沙門菌進(jìn)入類器官的上皮細(xì)胞，導(dǎo)致緊密連接的破壞。例如，在沙門菌感染的類器官中，緊密連接(tight junction,TJ)蛋白ZO-1染色減少并斷開連接(圖13.1)。有趣的是，TJ蛋白Claudin7似乎沒(méi)有受到影響。

在感染沙門菌的類器官中檢測(cè)了基于NF-kB通路激活的炎癥反應(yīng)。沙門菌感染的類器官中總kBα顯著減少，磷酸化IkBα增加，磷酸化NF-kB p65也有所增加。通過(guò)共聚焦顯微鏡觀察，研究人員發(fā)現(xiàn)NF-kB p65已轉(zhuǎn)移到感染沙門菌的類器官的細(xì)胞核中。作為NF-kB激活的下游靶點(diǎn)，與沒(méi)有任何感染的類器官相比，受感染類器官中的炎性細(xì)胞因子(例如，IL-2、IL-4、IL-6和TNF-a)顯著增加，而且，ELISA對(duì)沙門菌感染后1h培養(yǎng)液中IL-6蛋白的檢測(cè)靈敏度足夠高。感染1、2、4h后，培養(yǎng)基中的ⅡL-6 蛋白顯著增強(qiáng)(Zhang et al.,2014)。此外，western blot、PCR和免疫熒光數(shù)據(jù)表明，沙門菌感染(使用GFP標(biāo)志的Lgr5類器官)顯著降低了干細(xì)胞標(biāo)志物(Lgr5和Bmil)。