細(xì)胞污染的不同種類特征以及處理方式
細(xì)胞污染不能完全被消除，但能減少其發(fā)生的頻率和后果的嚴(yán)重性。一旦發(fā)現(xiàn)有細(xì)胞污染，我們?cè)撟鲂┦裁矗?/span>
一、判定細(xì)胞污染類并處理
細(xì)胞培養(yǎng)中最常見污染的是細(xì)菌、真菌、支原體和黑膠蟲污染，判斷細(xì)胞是否污染的一種簡(jiǎn)單方法是觀察培養(yǎng)基。我們將簡(jiǎn)要介紹幾種常見的細(xì)胞污染類型及處理方法。
01 細(xì)菌污染
特征：
◆ 細(xì)菌污染時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)基可能在4-6小時(shí)呈現(xiàn)混濁。
◆ 有時(shí)稍加震蕩，便會(huì)有很多混濁物漂起。
◆ 在顯微鏡下呈黑色細(xì)沙狀，或背景有大量黑點(diǎn)。
細(xì)菌污染可能造成細(xì)胞增殖緩慢或形態(tài)上的改變（多角、多核等），胞質(zhì)中產(chǎn)生空泡、細(xì)胞漂浮凋亡。
處理方法：
| 抗生素 | 作用對(duì)象 | 使用比例 | 儲(chǔ)存條件 |
| 卡那霉素溶液 | 細(xì)菌（如G+、G-、支原體） | 稀釋:1:100 | -20℃ |
| 硫酸慶大霉素溶液 | 細(xì)菌（如G+、G-、支原體） | 稀釋:1:1000 | AMB(15-30℃) |
| 青鏈雙抗 | 細(xì)菌（如G+、G-） | 稀釋:1:100 | -20℃ |
| 青鏈雙抗，10濃縮液 | 細(xì)菌（如G+、G-） | 稀釋:1:1000 | -20℃ |
| 青鏈霉素 制霉菌素三抗 |
細(xì)菌（如G+、G-）、 真菌（如：酵母菌、霉菌） |
稀釋:1:100 | -20℃ |
| 青鏈霉素 兩性霉素B三抗 |
細(xì)菌（如G+、G-）、 真菌（如：酵母菌、霉菌） |
稀釋:1:100 | -20℃ |
| 青鏈霉素，新霉素三抗 | 細(xì)菌（如G+、G-） | 稀釋:1:100 | -20℃ |
輕度細(xì)菌污染可用10X雙抗清洗處理，重度細(xì)菌污染建議消殺后丟棄。
02真菌污染
特征：
◆ 真菌污染最短3天才能長(zhǎng)出橢圓形的霉斑。
◆ 霉斑往往會(huì)漂浮在培養(yǎng)液表面，隨著時(shí)間逐步擴(kuò)大。
◆ 有些真菌呈類似棉花絮狀的漂浮物。
◆ 若是念珠菌會(huì)呈卵圓狀，在細(xì)胞周邊生長(zhǎng)。
根霉菌
◆ 早期并不會(huì)使得培養(yǎng)基變黃變渾濁，但在顯微鏡下可觀察到菌絲體。真菌形成的菌絲呈絲狀，管狀，樹枝狀，串珠狀。
酵母菌
◆ 酵母菌等，當(dāng)其行出芽生殖時(shí)可從一大一小的連體結(jié)構(gòu)識(shí)別。
◆ 細(xì)胞被污染后，仍可生長(zhǎng)，長(zhǎng)時(shí)間細(xì)胞的活力狀態(tài)會(huì)變差。
◆ 梅雨季時(shí)的污染率會(huì)提高。
◆ 呈卵圓狀酵母菌增殖到一定規(guī)模，形成團(tuán)簇狀的真菌群。
處理方法：
| 抗生素 | 作用對(duì)象 | 使用比例 | 儲(chǔ)存條件 |
| 兩性霉素B | 真菌（如：酵母菌、霉菌） | 稀釋:1:1000-1:10,000 | -20℃ |
| 制霉菌素 | 真菌（如：酵母菌、霉菌） | 稀釋:1:100-1:1000 | -20℃ |
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青鏈霉素 制霉菌素三抗 |
細(xì)菌（如G+、G-）、 真菌（如：酵母菌、霉菌） |
稀釋: 1:100 | -20℃ |
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青鏈霉素 兩性霉素B三抗 |
細(xì)菌（如G+、G-）、 真菌（如：酵母菌、霉菌） |
稀釋: 1:100 | -20℃ |
細(xì)胞真菌污染較難根除，不建議保留，建議消殺后丟棄。
03支原體污染
最小的微生物，無法通過光學(xué)顯微鏡看見，但可通過電鏡觀察到。
感染支原體的細(xì)胞，在某一時(shí)間點(diǎn)碎片突然增多，隨著傳代，細(xì)胞狀態(tài)顯著變差。
細(xì)胞支原體污染可通過氣溶膠傳播，影響同一細(xì)胞房其他細(xì)胞。
◆ 增殖減慢
◆ 上清液清澈
◆ 背景干凈
◆ 細(xì)胞形態(tài)異常（拉絲、鋪展）
◆ 更換新的培養(yǎng)液，細(xì)胞狀態(tài)沒有恢復(fù)
鑒定方法：
PCR法、顯色法、熒光染色法等。
示例1►EBTr (牛胚氣管細(xì)胞)
感染支原體的EBTr (牛胚氣管細(xì)胞)（成纖維樣）
感染了支原體的EBTr特征：1.由成纖維樣逐漸變得類上皮樣；2.質(zhì)膜鋪展，潰爛；3.輪廓不清，邊界模糊；4.凋亡細(xì)胞過多。
示例2►HT1080 (人纖維肉瘤細(xì)胞)
被支原體“附身”的HT1080
甩掉支原體的HT1080
處理方法：
◆ 若細(xì)胞污染后狀態(tài)尚可，添加支原體抑制劑培養(yǎng)2-3代可轉(zhuǎn)陰
◆ 若細(xì)胞污染后狀態(tài)很差，建議消殺后丟棄。
04 黑膠蟲污染
“黑膠蟲”可寄生于動(dòng)物細(xì)胞，也可以生存于培養(yǎng)基中，依靠細(xì)胞和培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)為生，并隨細(xì)胞傳代而傳代，是一種異養(yǎng)生物。
特征：
鏡下無法直接觀察到。主要表現(xiàn)為細(xì)胞狀態(tài)差，黑點(diǎn)和碎片多，布朗運(yùn)動(dòng)。通過檢測(cè)發(fā)現(xiàn)主要為細(xì)胞支原體污染，部分為未知的增殖不明顯的微生物污染。
處理方式：
◆ 若細(xì)胞污染后狀態(tài)尚可，添加黑膠蟲抑制劑/支原體抑制劑培養(yǎng)2-3代可轉(zhuǎn)陰
◆ 若細(xì)胞污染后狀態(tài)很差，建議消殺后丟棄。
二、改善個(gè)人操作及培養(yǎng)環(huán)境
01 清潔培養(yǎng)箱
發(fā)現(xiàn)細(xì)胞污染不能只處理這一個(gè)培養(yǎng)皿，還得看看這個(gè)恒溫培養(yǎng)箱里其他培養(yǎng)皿或孔板里的細(xì)胞是否污染。如果有而且好幾個(gè)板子都有類似的污染塊，那很可能是培養(yǎng)箱中的水或者空氣污染了，得給培養(yǎng)箱做個(gè)大掃除，重新酒精消毒，照紫外；孵箱里的水，不僅沒了得加還得記得十天半個(gè)月的就用酒精擦擦托盤。
02 整理潔凈臺(tái)
超凈臺(tái)不是儲(chǔ)物箱，什么培養(yǎng)皿、各種規(guī)格的板子、槍頭不要堆在超凈臺(tái)，會(huì)造成許多紫外線顧不到的衛(wèi)生死角。
細(xì)胞房其他的桌面，同樣切忌東西堆積如山，不要將酒精棉球、標(biāo)簽紙、牛皮紙買來后全部堆在細(xì)胞房，污染物一不小心“飄”進(jìn)你的細(xì)胞培養(yǎng)板里，細(xì)胞就會(huì)死給你看！
03 嚴(yán)格無菌操作
細(xì)胞房這種衛(wèi)生要求高的地方，人一旦多了救護(hù)增加許多不確定因素，難以保證試驗(yàn)在無菌條件下操作。出入試驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)服當(dāng)風(fēng)衣穿，不扣紐扣，不戴鞋套，猶入無人之境，來去自由；超凈臺(tái)做實(shí)驗(yàn)時(shí)，喜歡說話聊著做試驗(yàn)，殊不知你噴口氣，里面就有很多細(xì)菌。
規(guī)范操作是避免污染的最有效方式。
細(xì)胞培養(yǎng)間配備槍式移液器、手術(shù)器械、離心機(jī)、冰箱等專用儀器設(shè)備以及專用的實(shí)驗(yàn)服和拖鞋，并定期消毒。
專用物品只在培養(yǎng)間內(nèi)使用，不得帶出細(xì)胞房。無菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞。必要物品可暫時(shí)放置，其他實(shí)驗(yàn)用品用完即應(yīng)移出，以利于氣流的通暢。
培養(yǎng)細(xì)胞過程中使用的所有實(shí)驗(yàn)用具，如移液管、一次性槍頭、一次性塑料離心管、凍存管等需121°C高壓滅菌20分鐘后烤干備用，一些玻璃器皿如細(xì)胞培養(yǎng)瓶等須先泡酸、洗凈、晾干后再高壓滅菌。
