活細(xì)胞/死細(xì)胞雙染試劑盒（calceinAM/EthD-3）使用說明書

保存溫度
-20℃ 避光保存

有效期
一年

檢測方法
流式細(xì)胞儀/熒光顯微鏡 /激光共聚焦

適用樣本
細(xì)胞

產(chǎn)品應(yīng)用
流式細(xì)胞儀/熒光顯微鏡 /激光共聚焦

儀器準(zhǔn)備
流式細(xì)胞儀/熒光顯微鏡/激光共聚焦 、 離心機(jī)、移液器 、冰箱、 冰盒

試劑準(zhǔn)備
PBS緩沖液  或者HBSS

耗材準(zhǔn)備
離心管、 吸頭 、 一次性手套

使用注意事項(xiàng)
螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體收集至管底，避免開蓋時(shí)液體灑落。細(xì)胞處理需要小心操作,盡量避免人為的損傷細(xì)胞。 試劑A為DMSO溶液，冬季氣溫較低時(shí)在室溫時(shí)為凝固狀態(tài)，極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱溶解，吸頭也需要放在培養(yǎng)箱預(yù)熱，否者容易再次凝固在吸頭內(nèi)壁產(chǎn)生損耗。融解后離心至管底部再打開螺旋蓋。  試劑A為了便于觀察防止誤操作導(dǎo)致?lián)p失，在試劑盒中時(shí)是采用透明管包裝，收到后可以離心移入干燥黑色避光密封管或者用鋁箔包裹避光。 由于Calcein-AM的穩(wěn)定性比較差，染色工作液必須現(xiàn)配現(xiàn)用，并且在當(dāng)天用完。

alcein-AM對(duì)濕度非常敏感，若是Calcein-AM溶液每次取完需要量后，必須緊緊密封蓋子。建議根據(jù)單次用量，分裝密封保存。不可使用含水的吸頭。  試劑A母液請擰緊螺旋蓋，避免受潮失效。  染色液A為DMSO溶液，冬季氣溫較低時(shí)在室溫時(shí)為凝固狀態(tài)，極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱溶解，吸頭也需要放在培養(yǎng)箱預(yù)熱，否者容易再次凝固在吸頭內(nèi)壁產(chǎn)生損耗。  以下實(shí)驗(yàn)步驟僅供參考，以實(shí)際的樣本和文獻(xiàn)參考步驟進(jìn)行調(diào)整。可以染色懸浮培養(yǎng)細(xì)胞、貼壁細(xì)胞、制備的細(xì)胞爬片、涂片等原位染色。

使用方法
1. 染色工作液的配制： 根據(jù)樣品數(shù)按下列比例配制染色工作液。 用染料稀釋液試劑C將染色液A和B分別10倍稀釋。 每10ml HBSS緩沖液或無血清培養(yǎng)基中加入100μl稀釋過的染色液A，充分混勻，即成染色工作液A。 每10ml HBSS緩沖液或無血清培養(yǎng)基中加入20-200μl稀釋過的染色液B，充分混勻，即成染色工作液B。
2. 收集樣本細(xì)胞。
【注】：根據(jù)下游檢測儀器和應(yīng)用需要，貼壁細(xì)胞時(shí),可以先用胰酶-EDTA等消化細(xì)胞，制備成細(xì)胞懸液。也可以直接原位染色檢測。
3. 用PBS洗滌細(xì)胞兩次。
【注】：由于培養(yǎng)基中的血清等含有酯酶，導(dǎo)致Calcein-AM遇水會(huì)分解，會(huì)導(dǎo)致空白上升，所以需要用PBS洗滌數(shù)次直到完全洗凈。  貼壁細(xì)胞可以原位染色，注意吸除培養(yǎng)基前用培養(yǎng)板離心機(jī)離心，防止丟掉漂浮的死細(xì)胞。PBS洗滌時(shí)也需要離心培養(yǎng)板。
4. 用200μl染色工作液A將細(xì)胞重懸。
【注】： Calcein-AM溶液和EthD-I溶液分開進(jìn)行染色，先用Calcein-AM染色，再用EthD-I染色。  有時(shí)候可添加一定量的非離子表面活性劑如Pluronic F127到Calcein AM內(nèi)來增強(qiáng)其水溶性。制備染色工作液前，取一管需要用的Calcein AM內(nèi)加入20% Pluronic F127，使Pluronic F127的終濃度為0.02%。  含Pluronic F127的Calcein AM溶液不可長期保存，現(xiàn)配現(xiàn)用。
5. 在室溫或37℃避光孵育15-20分鐘。
6. 用PBS洗滌細(xì)胞。 【注】： 如有必要，使用含有陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑的緩沖液來進(jìn)行細(xì)胞清洗。
7. 用200μl染色工作液B將細(xì)胞重懸。
8. 在室溫或37℃避光孵育2-5分鐘。
9. 用PBS洗滌細(xì)胞。
10. 用適量PBS重懸細(xì)胞。
11. 用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果。最大激發(fā)為490nm，最大發(fā)射波長為515nm和617nm。 結(jié)果分析 ： 熒光顯微鏡下，使用490±10nm波長激發(fā)，活細(xì)胞為黃綠色，死細(xì)胞為紅色。 用528 nm波長激發(fā)，能夠看到紅色的死細(xì)胞。

常見問題分析
所有細(xì)胞都染上紅色？ EthD-3濃度過高會(huì)導(dǎo)致活細(xì)胞也被染色，需要優(yōu)化EthD-3的使用濃度，稀釋至僅對(duì)死細(xì)胞核染色，而不會(huì)對(duì)細(xì)胞質(zhì)染色的最佳工作濃度。  細(xì)胞被同時(shí)染上綠色和紅色？ 樣本中有大量晚期凋亡細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞胞漿會(huì)有Calcein著色并呈碎片狀，而且EthD-I也為陽性。