力誘導的一氧化氮促進小鼠正畸牙齒移動期間的成骨活性

正畸牙齒移動（OTM）是一個機械力誘導牙周組織改建的過程。壓力側(cè)的牙槽骨吸收和張力側(cè)新骨再生的平衡決定了OTM的速度。一氧化氮（NO）已被證明對骨代謝有影響。NO供體對成骨細胞的生長和骨形成具有有益的影響。同時，它們會降低破骨細胞的活性。研究指出，牙周組織在正畸力的作用下產(chǎn)生NO。NO的前體（L-精氨酸）加速了大鼠的OTM，增加了壓力側(cè)破骨細胞的數(shù)量和Howship腔隙，而抑制NO產(chǎn)生的NOS（一氧化氮合酶）抑制劑會減少OTM。因此，NO也對OTM產(chǎn)生了重大影響。

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了三種NOS亞型：神經(jīng)元型（nNOS）、內(nèi)皮細胞型（eNOS）和誘導型（iNOS）。已經(jīng)證明，eNOS介導張力側(cè)的骨形成，而iNOS介導壓力側(cè)的骨吸收。eNOS和iNOS似乎是OTM過程中骨重塑的關鍵調(diào)節(jié)因子，它們主要分布在骨細胞中。與骨細胞不同，牙周膜細胞在早期OTM階段更傾向于成為機械傳感器，與NO信號傳導有關。人牙周膜干細胞（hPDLSCs）是間充質(zhì)干細胞（MSCs），對維持牙周組織的穩(wěn)態(tài)至關重要。先前的證據(jù)表明，hPDLSCs參與OTM過程。循環(huán)拉伸力（CTF）促進hPDLSCs中成骨基因和蛋白質(zhì)的表達，如堿性磷酸酶、RUNX2、osterix 蛋白和骨橋蛋白。此外，機械應變可以刺激hPDLSCs分化成成骨細胞。

在首都醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院口腔正畸學教研室及全牙再生與口腔組織功能重建實驗室小組的一項研究中報道了hPDLSCs可以產(chǎn)生NO，NO具有促進PDLSCs成骨分化的能力。在這項研究中，重點研究了模擬OTM的過程的機械拉伸力對hPDLSCs產(chǎn)生NO變化的影響，還發(fā)現(xiàn)了骨代謝的變化以及這一過程中涉及的潛在信號通路。
正畸力誘導體內(nèi)NO產(chǎn)生和NOS表達

為了研究體內(nèi)OTM過程中NO的產(chǎn)生，使用小鼠正畸力（30g）模型進行研究（圖1 a）。施加力7天后，OTM的HE和顯微CT分析顯示，第一磨牙向內(nèi)側(cè)移動。觀察到遠端牙周膜變寬，而近中端牙周膜受壓（圖1 b-d）。與對照組相比，NO2- 濃度在施加正畸力的小鼠血清中升高（圖1 e）。
力誘導的NO調(diào)節(jié)OTM過程和骨形成

為研究力誘導的NO產(chǎn)生對OTM過程的影響，注射NOS抑制劑L-NMMA抑制其生成，并注射NO前體L-精氨酸以增加OTM過程中的內(nèi)源性NO生成（圖1 f-g）。施加力7天后，測量上頜第一磨牙和第二磨牙之間的距離。與對照組相比，L-NMMA對NOS的抑制作用縮短了OTM的距離。同時，注射L-精氨酸上調(diào)了NO水平并增加OTM的距離。

免疫組織化學染色顯示，與PBS對照組相比，在OTM期間阻斷內(nèi)源性NO的產(chǎn)生可抑制張力側(cè)牙周膜和牙槽骨中堿性磷酸酶陽性hPDLSCs和骨細胞的積累（圖2 a、b、d）。為了進一步確認NO在OTM中的功能，注射了L-精氨酸以提高小鼠的NO水平。結果顯示，與PBS對照組相比，張力側(cè)牙周膜和牙槽骨中堿性磷酸酶陽性hPDLSCs和骨細胞的積累增加（圖2 a、c、d）。 （a-c）遠端張力側(cè)的代表性免疫組織化學圖像。（b、d）L-NMMA注射顯著抑制牙周膜堿性表達，促進堿性磷酸酶的表達。

循環(huán)拉伸力在體外誘導NO生成和NOS表達

接下來，實驗研究了hPDLSCs的NO產(chǎn)生，這在OTM的骨形成過程中非常重要。此外，通過免疫染色評估發(fā)現(xiàn)人hPDLSCs表達eNOS和iNOS。為了研究NO產(chǎn)生的機制，對hPDLSCs施加循環(huán)拉伸力（10%伸長率，0.5 Hz，6、12、24 h），以在體外探索機械力對NO產(chǎn)生的影響。已經(jīng)證明，hPDLSCs在沒有力刺激的情況下產(chǎn)生NO。檢測hPDLSCs的培養(yǎng)上清液中NO2- 的濃度，結果發(fā)現(xiàn)，在12小時和24小時后顯著增加（圖3 a）。蛋白質(zhì)印跡結果顯示，eNOS和iNOS蛋白表達上調(diào)，qPCR結果顯示相同的趨勢（圖3 b、c）。這些數(shù)據(jù)表明，施加CTF在hPDLSCs中促進NO 生成，這可能對生物學功能產(chǎn)生影響。
力誘導的 NO 可能會調(diào)節(jié) OTM 期間張力側(cè)的骨形成

實驗假設OTM期間張力側(cè)的骨形成可能是力誘導的NO通過hPDLSCs的成骨分化調(diào)控的。先前的研究表明，循環(huán)拉伸力促進了hPDLSCs的成骨分化。實驗用CTF處理hPDLSCs 持續(xù)0小時，6小時，12小時和24小時，qPCR檢測到RUNX2，Osterix和骨橋蛋白mRNA水平升高（圖3 d）。RUNX2的蛋白質(zhì)印跡結果顯示出相同的趨勢（圖3 e）。

為了研究不同濃度的NO對成骨的影響，用L-NMMA處理hPDLSCs以降低NO2- 的濃度，結果發(fā)現(xiàn)在體外循環(huán)拉伸力下，外源NO供體硝普鈉（SNP）增加NO2-的濃度（圖3 f）。qPCR結果顯示，在CTF期間NO產(chǎn)生受到抑制時，RUNX2、Osterix和骨橋蛋白mRNA表達降低，而在CTF期間促進NO生成時，它們的表達增加（圖3 g）。RUNX2的蛋白質(zhì)印跡顯示出相同的趨勢（圖3 h）。

hPDLSCs 中的力誘導的 NO 可能調(diào)控 PI3K/Akt 信號通路

為了研究力誘導的NO如何影響hPDLSCs的成骨，實驗分析了NO下游通路PI3K/Akt。刺激hPDLSCs后，p-PI3K、p-Akt和活性β-連環(huán)蛋白的表達水平上調(diào)（圖4 a）。然后，用PI3K抑制劑LY294002 處理hPDLSCs，發(fā)現(xiàn)p-PI3K、p-Akt和活性β-連環(huán)蛋白的表達水平下調(diào)（圖4 b）。此外，用NO抑制劑L-NMMA處理hPDLSCs，發(fā)現(xiàn)L-NMMA抑制了CTF處理下hPDLSCs中PI3K/Akt通路的促進（圖4 c）。
由于NO在OTM中的功能作用尚未完全闡明，該研究證明，力誘導的內(nèi)源性NO促進PDLSCs的成骨活性，有助于維持OTM期間牙槽骨的穩(wěn)態(tài)。NO是調(diào)節(jié)OTM過程所必需的，NO水平的降低導致OTM距離縮短。隨著對NO在OTM中的作用的認識的加深，可能會帶來一種基于NO供體的OTM的加速治療方法。

參考文獻：Sun Y, Fu J, Lin F, Li S, Du J, Liu Y, Bai Y. Force-Induced Nitric Oxide Promotes Osteogenic Activity during Orthodontic Tooth Movement in Mice. Stem Cells Int. 2022 Sep 6;2022:4775445. doi: 10.1155/2022/4775445. PMID: 36110889; PMCID: PMC9470363.

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36110889/

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