機械超負荷誘導(dǎo)的miR-325-3p降低促進軟骨細胞衰老，加劇小關(guān)節(jié)退變

腰痛（LBP）影響健康的常見疾病之一，終生患病率接近80%。小關(guān)節(jié)退變（Facet joint degeneration）約占慢性LBP的30%。脊柱小關(guān)節(jié)即關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)，位于脊柱的兩側(cè)，由上關(guān)節(jié)突和下關(guān)節(jié)突組成。生物力學(xué)結(jié)構(gòu)的改變和合成代謝的紊亂最終導(dǎo)致小關(guān)節(jié)退變，其特征是軟骨變薄、軟骨下骨硬化和關(guān)節(jié)間隙變窄。近年來，雙足站立模型已被公認為研究小關(guān)節(jié)退變的理想工具。小鼠站立10周后，小關(guān)節(jié)出現(xiàn)明顯退變，國際骨關(guān)節(jié)炎研究學(xué)會（OARSI）評分等級和基質(zhì)金屬蛋白酶13（MMP13）升高，而膠原蛋白II降低。

細胞衰老是一種以細胞周期停滯為特征的穩(wěn)定狀態(tài)。衰老細胞高度表達P53、P21、P16和衰老相關(guān)-β-半乳糖苷酶（SA-β-gal），可以釋放衰老相關(guān)的分泌表型（SASP），包括炎性細胞因子、趨化因子、生長因子和蛋白酶，以影響周圍細胞。在關(guān)節(jié)退變中，衰老細胞的存在加劇了關(guān)節(jié)軟骨的破壞，而抑制細胞衰老可改善軟骨細胞穩(wěn)態(tài)并緩解骨關(guān)節(jié)炎進展。據(jù)報道，在膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎中，機械超負荷可下調(diào)F-box和WD重復(fù)結(jié)構(gòu)域7（FBXW7）泛素連接酶的表達并激活JNK通路，從而促進軟骨細胞衰老。另一項研究報道，機械超負荷誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎伴有軟骨細胞衰老，而尿石素A可通過恢復(fù)線粒體穩(wěn)態(tài)來減少軟骨細胞衰老，從而緩解骨關(guān)節(jié)炎的進展。然而，機械超負荷是否引起腰椎小關(guān)節(jié)軟骨細胞衰老以及具體機制如何尚未報道。

MicroRNAs是一系列長度為21-23nt的非編碼RNA，通過沉默或降解mRNA分子調(diào)控基因表達。MicroRNAs廣泛參與軟骨細胞穩(wěn)態(tài)和骨關(guān)節(jié)炎。小關(guān)節(jié)退變伴有microRNA表達的改變。使用反義寡核苷酸抑制miR-181a-5p可減輕小關(guān)節(jié)軟骨退變的嚴重程度。包括microRNAs在內(nèi)的非編碼RNAs在軟骨細胞衰老中起重要作用。據(jù)報道，MiR-29b-5p可緩解軟骨細胞衰老，p21和p16表達降低。然而，機械超負荷是否通過microRNAs調(diào)節(jié)軟骨細胞衰老仍然未知。

在湖南省中南大學(xué)湘雅醫(yī)院脊柱外科、器官損傷衰老與再生醫(yī)學(xué)湖南省重點實驗室等研究團隊一項研究中，證明了機械超負荷誘導(dǎo)的miR-325-3p降低可以通過增加trp53表達來促進軟骨細胞衰老。利用AAV上調(diào)miR-325-3p表達可有效減輕軟骨細胞衰老，緩解小關(guān)節(jié)退變的進展，為小關(guān)節(jié)退變提供潛在的治療方法。
 

 

人和小鼠小關(guān)節(jié)退變伴有軟骨細胞衰老

實驗首先探究了退變對軟骨衰老的影響。從患者手術(shù)中獲得小關(guān)節(jié)軟骨，HE染色顯示，退變的FJ軟骨變薄，膠原蛋白成分減少（圖1 A）。 Safranin O還表明，退變FJs的軟骨細胞大大減少（圖1 B）。與正常關(guān)節(jié)相比，退變關(guān)節(jié)的OARSI評分升高（圖1 C）。與正常組織相比，退變FJ的P53陽性或P21陽性軟骨細胞增加（圖1 D-G）。

然后進一步研究了小鼠退變FJ中是否也存在細胞衰老，使用雙足站立模型誘導(dǎo)小鼠FJ退變，這顯著增加了脊柱軸向應(yīng)力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠兩側(cè)的小關(guān)節(jié)退變沒有顯著差異。與對照組相比，站立10周后，關(guān)節(jié)軟骨變薄，軟骨細胞減少，OARSI評分升高（圖1 H-J）。免疫組化（IHC）染色還表明，站立10周后，小鼠P53和P21陽性細胞明顯增加（圖1 K-N）。這些結(jié)果表明，F(xiàn)J退變表現(xiàn)出骨關(guān)節(jié)炎的特征，伴有軟骨細胞衰老。

 

圖1   軟骨細胞衰老與人類和小鼠的腰椎小關(guān)節(jié)（FJ）退變有關(guān)。

體外機械超負荷誘導(dǎo)的軟骨細胞衰老和SASP釋放

為了探索體外機械負荷是否會影響軟骨細胞衰老，分離了原代軟骨細胞，在0.5 Hz的頻率下，用5%和20%的拉伸應(yīng)力加載0h、6h、12h和24h。在5%的拉伸應(yīng)力下，處理6 h后膠原蛋白II含量差異不顯著，12h和24h后其含量增加。在20%的拉伸應(yīng)力下，膠原蛋白II含量逐漸降低（圖2 A、B）。Col2a1的qRT-PCR顯示出類似的趨勢（圖2 C）。在5%的拉伸應(yīng)力下，MMP13表達逐漸降低，而在20%拉伸應(yīng)力下呈時間依賴性逐漸升高（圖2 D）。

然后進一步對SA-β-gal和P21 進行染色，以評估機械應(yīng)力對軟骨細胞衰老的影響。在5%拉伸應(yīng)力下，SA-β-gal陽性細胞的比例無統(tǒng)計學(xué)差異。在20%拉伸應(yīng)力下，SA-β-gal陽性細胞的數(shù)量隨刺激時間的延長而增加（圖2 E、G）。P21（紅色）的免疫熒光染色顯示出類似的趨勢（圖2 F、H）。qRT-PCR結(jié)果顯示，在20% 拉伸應(yīng)力作用24h后，PAI-1、IL-6和TGF-β等SASP因子顯著升高（圖2 I）。這些結(jié)果表明，適當(dāng)?shù)臋C械應(yīng)力有利于軟骨細胞的合成代謝，并且不會導(dǎo)致軟骨細胞衰老。然而，過度的機械應(yīng)力不利于細胞合成代謝并導(dǎo)致軟骨細胞衰老。

 

圖2   體外過度的機械負荷誘導(dǎo)軟骨細胞衰老。

 

過度機械應(yīng)力下軟骨細胞中MiR-325-3p下調(diào)

為了探索機械超負荷誘導(dǎo)的軟骨細胞衰老的機制，通過篩選關(guān)節(jié)退變和骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的microRNAs進行了microRNA陣列分析。結(jié)果顯示，在這些microRNAs中，miR-325-3p的降低最為顯著。接下來檢測了小鼠腰椎小關(guān)節(jié)中的miR-325-3p表達。結(jié)果顯示，miR-325-3p主要在軟骨層表達，與對照組相比，站立10周后明顯下調(diào)。這些結(jié)果表明，機械過載降低了miR-325-3p在體內(nèi)和體外的表達。

體外MiR-325-3p過表達挽救機械超負荷誘導(dǎo)的軟骨細胞衰老

為了研究miR-325-3p在機械超負荷誘導(dǎo)的軟骨細胞衰老中的作用，構(gòu)建了miR-325-3p模擬物和抑制劑。在沒有拉伸應(yīng)力下，miR-325-3p抑制劑降低了膠原蛋白II的表達，衰老軟骨細胞（SA-β-gal和P21陽性細胞）的數(shù)量增加，衰老相關(guān)基因P21、P16、P53和SASP因子PAI-1、IL-6和TGF-β上調(diào)。

然后，在20%的拉伸應(yīng)力下施用miR-325-3p模擬物，以確認miR-325-3p對軟骨細胞衰老的影響。在機械過載下，miR-325-3p模擬物顯著增加膠原II表達。在20%拉伸應(yīng)力處理24h后，miR-325-3p模擬物可以減少衰老軟骨細胞（SA-β-gal陽性細胞和p21陽性細胞）的數(shù)量，明顯降低了衰老相關(guān)基因P21、P16、P53和SASP因子PAI-1、IL-6和TGF-β的表達。這些結(jié)果表明，miR-325-3p可以挽救機械超負荷誘導(dǎo)的軟骨細胞損傷和衰老。

 

小鼠雙足站立模型中表達AAV的miR-325-3p減輕機械超負荷誘導(dǎo)的軟骨細胞衰老和FJ退變

為了探究miR-325-3p對體內(nèi)軟骨細胞衰老和FJ退變的影響，構(gòu)建了表達miR-325-3p的腺相關(guān)病毒（AAV）。AAV-miR-325-3p促進了軟骨細胞中miR-325-3p的表達（圖3 A、B）。HE和safranin O染色表明，AAV-miR-325-3p增加了軟骨厚度和軟骨細胞數(shù)量（圖3 C）。在給予AAV-miR-325-3p后，OARSI評分也升高（圖3 D）。

為了評估AAV-miR-325-3p對軟骨細胞衰老的影響，進行了p53和p21的IHC。與對照組相比，接受AAV-NC的實驗小鼠p53和p21陽性細胞數(shù)量增加，而關(guān)節(jié)內(nèi)注射AAV-miR-325-3p時衰老軟骨細胞減少（圖3 E-H）。IHC染色顯示，AAV-miR-13-325p處理后，膠原蛋白II陽性和蛋白聚糖陽性軟骨細胞數(shù)量明顯升高，而MMP 13陽性細胞減少。這些結(jié)果表明，表達miR-325-3p的AAV可以有效延緩軟骨細胞衰老，減輕機械超負荷引起的FJ退變。

 

圖3   AAV-miR-325-3p OE（過表達）緩解站立模型小鼠腰椎小關(guān)節(jié)軟骨衰老。

 

MiR-325-3p 通過靶向 trp53 減輕軟骨細胞衰老

實驗最后進一步探討了miR-325-3p調(diào)控軟骨細胞衰老的機制。通過預(yù)測miR-325-3p的下游靶基因和與衰老相關(guān)的GO通路相交，發(fā)現(xiàn)了5個潛在基因（Trp53，TBX，SRF，Trp63，P21）（圖4 A）。隨后，通過qRT-PCR發(fā)現(xiàn)，用miR-325-3p模擬物處理后，軟骨細胞中Trp53和P21表達明顯降低，而TBX、SRF和Trp63的表達沒有差異（圖4 B）。然后驗證了miR-325-3p和Trp53之間的結(jié)合關(guān)系。Trp53的3′UTR具有與miR-325-3p互補的序列（圖4 C）。雙熒光素酶報告基因測定的結(jié)果表明，當(dāng)用野生型Trp53質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293個T細胞時，miR-325-3p模擬物降低了熒光素酶活性。當(dāng)273個T細胞用突變體Trp53質(zhì)粒轉(zhuǎn)染時，未觀察到任何變化，表明miR-325-3p可以直接靶向Trp53（圖4 D）。

為了進一步探討miR-325-3p是否通過調(diào)控Trp53抑制軟骨細胞衰老，使用了濃度為0.5 μM的p53激活劑NSC-207895。首先探討了miR-325-3p模擬物處理后NSC-207895對機械應(yīng)力下軟骨細胞的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NSC-207895可以逆轉(zhuǎn)miR-325-3p在機械過載下對軟骨細胞的促進合成代謝作用。然后，SA-β-gal染色和P21（紅色）染色顯示，miR-325-3p減輕機械過載誘導(dǎo)的軟骨細胞衰老，SA-β-gal陽性細胞和p21陽性細胞減少，但當(dāng)用NSC-207895處理時，這種效果減弱（圖4 E-G）。此外，NSC-207895在mRNA和蛋白質(zhì)水平上分別降低了miR-325-3p模擬物下調(diào)P16、P21和P53表達的作用（圖4 H-J）。同時，miR-325-3p降低了SASP因子PAI-1、IL-6和TGF-β的表達，然而，NSC-207895 減弱了這種效果（圖4 H）。這些結(jié)果表明，miR-325-3p通過抑制Trp53表達來減輕軟骨細胞衰老和SASP釋放。

 

圖4   靶向P53的miR-325-3p和NSC-207895 在體外逆轉(zhuǎn)miR-325-3p抑制機械應(yīng)力誘導(dǎo)的細胞衰老的作用。

總之，該研究表明，miR-325-3p通過激活p53/p21通路來減少軟骨細胞衰老并減輕機械過載誘導(dǎo)的脊柱小關(guān)節(jié)退變，這可能為延緩脊柱小關(guān)節(jié)退變進展提供潛在的治療策略。

參考文獻：Zhao J, Li C, Qin T, Jin Y, He R, Sun Y, Liu Z, Wu T, Duan C, Cao Y, Hu J. Mechanical overloading-induced miR-325-3p reduction promoted chondrocyte senescence and exacerbated facet joint degeneration. Arthritis Res Ther. 2023 Apr 4;25(1):54. doi: 10.1186/s13075-023-03037-3. PMID: 37016437; PMCID: PMC10071751.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37016437/

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