裸鼠成瘤（CDX）模型的建立與應(yīng)用

乳腺癌是全世界最常見的一種女性惡性腫瘤。三陰性乳腺癌(TNBC)是指雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和人表皮生長因子受體2（HER2）的表達均為陰性的乳腺癌，約占所有乳腺癌病理類型的15%～20%。本研究發(fā)現(xiàn)，一種經(jīng)雌激素誘導(dǎo)的名為RING finger protein 208 （RNF208）的E3連接酶蛋白，可以經(jīng)泛素化直接降解波形蛋白，從而抑制TNBC細胞的轉(zhuǎn)移。

 

波形蛋白是一種中間絲蛋白，在侵襲性上皮癌中高度表達，包括乳腺癌，前列腺癌，胃癌，惡性黑色素瘤和肺癌，其表達水平與轉(zhuǎn)移風(fēng)險增加有關(guān)。波形蛋白的異常表達僅限于乳腺癌細胞中的TNBC細胞，加劇了乳腺癌細胞的侵襲。

 

RNF208在TNBC中顯著低于管腔型，并且RNF208的低表達與不良的臨床結(jié)果密切相關(guān)。RNF208的過表達抑制TNBC細胞的腫瘤形成和肺轉(zhuǎn)移。從機制上講，RNF208通過與磷酸化的波形蛋白的Ser39殘基相互作用，促進波形蛋白蛋白酶體降解，從而抑制TNBC細胞的腫瘤形成和轉(zhuǎn)移。

 

01

RNF208過表達減少腫瘤生長和肺轉(zhuǎn)移—實驗驗證

 

驗證RNF208在乳腺癌癥進展中的生理功能

 

1、首先在體外和體內(nèi)研究RNF208的表達水平是否影響腫瘤的發(fā)生。結(jié)果表明RNF208過表達顯著降低了TNBC細胞的增殖（圖1）。

圖1 RNF208過表達Hs578T和MDA-MB-231細胞的倍增曲線

 

2、為了進一步測試RNF208對體內(nèi)TNBC細胞致瘤能力的影響，將RNF208-tolu TNBC細胞皮下注射到免疫缺陷小鼠。RNF208的過表達顯著減小了TNBC細胞的腫瘤體積（圖2）。

圖2 將過表達TNBC的細胞經(jīng)皮下注射到NOD/SCID小鼠（每組n=6），8周后處死（Hs578和MDA-MB-231），腫瘤大�。ㄉ希┖湍[瘤體積（下）

使用無異源可注射的VitroGel水凝膠VHM01 /TWG003包裹TNBC細胞進行移植。分別比較轉(zhuǎn)染空載體(LPCX)（對照組），轉(zhuǎn)染RNF208過表達載體（實驗組）的Hs578T和MDA-MB-231兩種細胞。在本次小鼠植瘤實驗中，與對照組相比，過表達RNF208組中的波形蛋白表達水平降低，腫瘤生長明顯受到抑制。

 

3、此外，細胞增殖標志物Ki-67的表達降低，而細胞死亡標志物caspase-3在RNF208過表達的原發(fā)性腫瘤組織中與對照組織相比增加（圖3）。

 

圖3 原發(fā)性腫瘤組織中表達Ki67和RNF208 IHC圖像（上），細胞死亡標志物caspase-3表達對比（下）

 

02

成瘤能力檢測試驗

 

將TNBC細胞注射到6周齡NOD/SCID小鼠（每組n=5）。以轉(zhuǎn)移到肺為標志，比較對照組和細胞受RNF208保護的實驗組的轉(zhuǎn)移潛能。VitroGel 水凝膠在室溫條件下十分穩(wěn)定，可直接與細胞懸液混合，在與細胞混合后數(shù)小時內(nèi)仍然維持可注射的狀態(tài)。研究者還可以通過直接向細胞懸液中加入各種添加物，完全掌控培養(yǎng)體系中的營養(yǎng)成分。本研究將TNBC細胞重懸于1:3 PBS/VitroGel RGD水凝膠溶液中，皮下注射到小鼠體內(nèi)，測量腫瘤生長（圖4）。
 

圖4 對照組和注射NF208過表達MDA-MB-231-Luc的NOD/SCID小鼠（每組n=5）6至8周肺部的生物發(fā)光圖像（左圖），India ink染色肺組織顯示轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)（右上圖），散點圖顯示無轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)的數(shù)量（右下圖）

 

結(jié)果顯示，在實驗組RNF208過表達組中，TNBC細胞遷移和侵襲能力顯著降低。本研究結(jié)果表明RNF208的表達水平與波形蛋白介導(dǎo)的乳腺癌細胞侵襲性癌癥進展密切相關(guān)。

 

03

體內(nèi)腫瘤形成和肺轉(zhuǎn)移實驗

實驗動物：NOD/ShiLtJ-Rag2em1AMC Il2rgem1AMC 小鼠

細胞系：Hs578T、MDA-MB-231

細胞外基質(zhì)：水凝膠VitroGel（貨號：VHM01 /TWG003）

檢測內(nèi)容：測量腫瘤大小

研究周期：4-8周

 

體內(nèi)腫瘤形成實驗：

1)將1×10⁷逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的Hs578T和MDA-MB-231細胞重懸于1:3 PBS/水凝膠(TheWell Bioscience)溶液中。

2)皮下注射至6周齡雌性NOD/ShiLtJ-Rag2em1AMC Il2rgem1AMC 小鼠（n = 6只/組）中。
3)注射后第4周開始每周監(jiān)測腫瘤大小，用公式V=(A×B²)/2計算腫瘤體積，其中V為體積(mm³)，A為長徑(mm)，B為短徑(mm)。

肺轉(zhuǎn)移實驗：

1)1×10⁶ 逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的MDA-MB-231-Luc細胞通過尾靜脈注射至雌性NOD/SCID小鼠體內(nèi)。
2)注射后4周開始每周監(jiān)測肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生情況，采用IVS-200系統(tǒng)(Xenogen Corp)檢測生物發(fā)光信號。
3)對肺組織進行染色，計數(shù)結(jié)節(jié)并進行分析。腫瘤組織用10%福爾馬林溶液固定，石蠟塊包埋。用相應(yīng)抗體染色，進行免疫組化實驗。
 

VitroGel水凝膠擁有成分明確、室溫下操作、良好的流變性等特點，已經(jīng)成功應(yīng)用于多種細胞系的成瘤研究，擁有較高的腫瘤形成效率。

 

圖5  VitroGel水凝膠應(yīng)用于動物成瘤案例

參考文獻：

Pang, K., Park, J., Ahn, S.G. et al. RNF208, an estrogen-inducible E3 ligase, targets soluble Vimentin to suppress metastasis in triple-negative breast cancers. Nat Commun 10, 5805 (2019). https://doi.org/10.1038/s41467-019-13852-5

 

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