蛋白質(zhì)組定量方法之SILAC穩(wěn)定同位素標(biāo)記定量方法詳解
概覽
功能特點(diǎn)
SILAC作為一種基于一級質(zhì)譜標(biāo)記定量的方法，在蛋白質(zhì)組的定量中應(yīng)用越來越多[1]。在這種代謝標(biāo)記策略中，不同的同位素標(biāo)簽標(biāo)記的樣品（蛋白/多肽）在實(shí)驗(yàn)過程中的早期就被混合到一起，并且同時(shí)通過LC-MS/MS進(jìn)行分析。這樣從樣品處理過程中引入的系統(tǒng)誤差是最小的了。由于穩(wěn)定同位素標(biāo)記的多肽與它們對應(yīng)的天然形式的多肽有幾乎相同的理化性質(zhì)，所以，不同標(biāo)簽標(biāo)記的同一肽段在液相梯度下是共流出的，并且它們的數(shù)量可以通過互相關(guān)聯(lián)來精確定量。
這類標(biāo)記策略擴(kuò)展后稱為super-SILAC [2,3]，其中標(biāo)記的樣本可以單獨(dú)產(chǎn)生，并加入到無法進(jìn)行代謝標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)樣品中，例如人體組織。這樣重標(biāo)蛋白質(zhì)的混合樣品被用作定量的內(nèi)參。
PEAKS Q支持SILAC及super-SILAC的數(shù)據(jù)分析。
PEAKS Q中的SILAC定量算法
01在相關(guān)的SILAC特征峰對之間實(shí)現(xiàn)ID傳輸
PEAKS Q檢測并且關(guān)聯(lián)2標(biāo)或3標(biāo)，在一定保留時(shí)間內(nèi)具有相同電荷，相似的MS1特征峰型、在預(yù)期內(nèi)的由標(biāo)記所引起的質(zhì)量偏移，且處在一定質(zhì)量誤差范圍內(nèi)的SILAC特征峰對。如果從其中一種標(biāo)記狀態(tài)的feature中通過MS2譜圖得到鑒定信息，那么就可以對整個(gè)SILAC特征峰對進(jìn)行定量，并用于肽和蛋白質(zhì)比率的計(jì)算。例如，GLGDCLVK這條肽段的輕標(biāo)在sample R_2中得到了二級碎裂和鑒定信息[4]。盡管在K8標(biāo)記的對應(yīng)重標(biāo)中沒有得到二級譜圖，通過PEAKS Q檢測到SILAC特征峰對，就可以仍然對其進(jìn)行定量，正如下圖特征峰列表選中的高亮一行。“ID Count”表示從每一個(gè)SILAC特征峰對中得到的二級質(zhì)譜鑒定數(shù)目。
02在不同MS run之間通過特征峰對齊后進(jìn)行ID-Transfer
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細(xì)胞培養(yǎng)條件下的穩(wěn)定同位素標(biāo)記方法(SILAC) 一種非常流行的基于質(zhì)譜方法開發(fā)的蛋白質(zhì)組定量方法。
功能特點(diǎn)
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精確且靈敏的SILAC成對特征峰的檢測和關(guān)聯(lián)方法
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在相關(guān)聯(lián)的SILAC特征峰對，或不同MS run之間實(shí)現(xiàn)ID-Transfer，減少缺失值。
-
靈活的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以及統(tǒng)計(jì)工具幫助數(shù)據(jù)分析
SILAC作為一種基于一級質(zhì)譜標(biāo)記定量的方法，在蛋白質(zhì)組的定量中應(yīng)用越來越多[1]。在這種代謝標(biāo)記策略中，不同的同位素標(biāo)簽標(biāo)記的樣品（蛋白/多肽）在實(shí)驗(yàn)過程中的早期就被混合到一起，并且同時(shí)通過LC-MS/MS進(jìn)行分析。這樣從樣品處理過程中引入的系統(tǒng)誤差是最小的了。由于穩(wěn)定同位素標(biāo)記的多肽與它們對應(yīng)的天然形式的多肽有幾乎相同的理化性質(zhì)，所以，不同標(biāo)簽標(biāo)記的同一肽段在液相梯度下是共流出的，并且它們的數(shù)量可以通過互相關(guān)聯(lián)來精確定量。
這類標(biāo)記策略擴(kuò)展后稱為super-SILAC [2,3]，其中標(biāo)記的樣本可以單獨(dú)產(chǎn)生，并加入到無法進(jìn)行代謝標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)樣品中，例如人體組織。這樣重標(biāo)蛋白質(zhì)的混合樣品被用作定量的內(nèi)參。
PEAKS Q支持SILAC及super-SILAC的數(shù)據(jù)分析。
PEAKS Q中的SILAC定量算法
01在相關(guān)的SILAC特征峰對之間實(shí)現(xiàn)ID傳輸
PEAKS Q檢測并且關(guān)聯(lián)2標(biāo)或3標(biāo)，在一定保留時(shí)間內(nèi)具有相同電荷，相似的MS1特征峰型、在預(yù)期內(nèi)的由標(biāo)記所引起的質(zhì)量偏移，且處在一定質(zhì)量誤差范圍內(nèi)的SILAC特征峰對。如果從其中一種標(biāo)記狀態(tài)的feature中通過MS2譜圖得到鑒定信息，那么就可以對整個(gè)SILAC特征峰對進(jìn)行定量，并用于肽和蛋白質(zhì)比率的計(jì)算。例如，GLGDCLVK這條肽段的輕標(biāo)在sample R_2中得到了二級碎裂和鑒定信息[4]。盡管在K8標(biāo)記的對應(yīng)重標(biāo)中沒有得到二級譜圖，通過PEAKS Q檢測到SILAC特征峰對，就可以仍然對其進(jìn)行定量，正如下圖特征峰列表選中的高亮一行。“ID Count”表示從每一個(gè)SILAC特征峰對中得到的二級質(zhì)譜鑒定數(shù)目。
02在不同MS run之間通過特征峰對齊后進(jìn)行ID-Transfer
在不同MS run之間，首先對保留時(shí)間對齊，MS/MS和ID信息可以通過在較為狹窄的質(zhì)量范圍和保持時(shí)間內(nèi)，通過對齊特征峰的方式從另一次MS run中匹配，這就允許在這種沒有任何ID的SILAC特征峰，仍能對其進(jìn)行定量。
References
- Ong, S. E., Blagoev, B., Kratchmarova, I., Kristensen, D. B., et al., Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & cellular proteomics : MCP 2002, 1, 376-386.
- Neubert, T. A., Tempst, P., Super-SILAC for tumors and tissues. Nature methods 2010, 7, 361-362.
- Geiger, T., Cox, J., Ostasiewicz, P., Wisniewski, J. R., Mann, M., Super-SILAC mix for quantitative proteomics of human tumor tissue. Nature methods 2010, 7, 383-385.
- Liberski, A. R., Al-Noubi, M. N., Rahman, Z. H., Halabi, N. M., et al., Adaptation of a commonly used, chemically defined medium for human embryonic stem cells to stable isotope labeling with amino acids in cell culture. Journal of proteome research 2013, 12, 3233-3245.
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