BMG酶標(biāo)儀使用教程系列：如何優(yōu)化微孔板讀板機測量的焦距

瀏覽次數(shù)：920　發(fā)布日期：2023-8-25　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

你知道嗎？
BMG LABTECH讀板機的焦距設(shè)置范圍為0-25毫米（底部光學(xué)器件為0-9.7毫米）。這個距離是從微板的底部或頂部測量的，這分別取決于使用的是頂部還是底部光學(xué)器件。

用相機或手機拍照時，保持焦點以獲得最佳效果很重要，對吧？同樣的道理也適用于微孔板讀板機中的光學(xué)系統(tǒng)！此How To Note將重點介紹焦距設(shè)置，使您能夠調(diào)整微孔板讀板機的焦點。

在微孔板讀板機中，焦距被定義為檢測系統(tǒng)和微孔板（即樣品）之間的距離。最佳焦距指示微孔板讀板機可以檢測樣品的最高信號強度的平面。使用非最佳焦距進(jìn)行測量會對結(jié)果產(chǎn)生負(fù)面影響。

圖1：微孔板讀板機上的焦距曲線

不同型號的微孔板讀板機和來自不同制造商的讀板機的功能各不相同：焦距可能不可調(diào)節(jié)，可能必須手動輸入，也可以自動確定。沒有焦距調(diào)節(jié)的儀器通常是靈敏度有限的入門級設(shè)備。具有手動焦距設(shè)置的裝置需要一些試驗和試錯來憑經(jīng)驗確定特定測定的最佳高度。在測量前進(jìn)行焦點調(diào)整的微孔板讀板機自動識別特定樣品或一組樣品的最佳焦距（圖1）。一旦確定，您可以在體積和微孔板類型保持不變的情況下使用與之前測量相同的焦距。

你知道嗎？
從底部讀數(shù)時，焦距取決于使用的微孔板和其他因素，包括其底層的厚度。

由于液體樣品的物理性質(zhì)，信號強度通常在樣品的液體表面下方稍低的地方達(dá)到最高。微孔板讀板機將通過識別具有最高信號強度的平面來相應(yīng)地確定最佳焦距。增加焦距將使光學(xué)焦點在液體表面上方移動。相反，減小焦距將使光學(xué)焦點向微孔板底部的方向移動。在這兩種情況下，樣品的信號強度將降低，信號與空白的比率（圖2）和測定窗口將降低。

圖2：焦距設(shè)置對信噪比的影響

在本案例中，在不同的焦點高度測量100nM的熒光基團(tuán)標(biāo)準(zhǔn)樣品和空白樣品，計算并繪制了相應(yīng)的信噪比（S/B）與焦距的關(guān)系圖。自動焦距調(diào)節(jié)產(chǎn)生了9.3mm的最佳焦距，并獲得了所有測試結(jié)果的最佳S/B值。當(dāng)偏離確定的最佳值時，S/B值顯著降低。

值得注意的是，不同應(yīng)用的最佳焦距可能不同，它取決于平板類型、加樣體積和測定類型。例如，當(dāng)測量粘附細(xì)胞樣品時，信號強度通常位于微板孔的底部。

次優(yōu)焦距設(shè)置不僅會影響測量樣本的信號強度。它也會影響數(shù)據(jù)變化（圖3）。與使用非最佳焦距時會降低的信號與空白比相比，樣品重復(fù)之間的變化（%CV）會增加，從而進(jìn)一步降低測定的讀數(shù)質(zhì)量。

焦距設(shè)置也會影響數(shù)據(jù)點的變化。為了強調(diào)這一原理，我們計算了在不同焦距下三個重復(fù)的測量的100nM熒光基團(tuán)標(biāo)準(zhǔn)樣品的%CV值。如圖3所示，在微孔板讀板機確定的最佳焦距9.3下進(jìn)行測量時，獲得了最低的%CV值。在偏離該最佳值的焦高處的測量導(dǎo)致更大的變異。雖然對于低于最佳高度的焦高，%CV的增加不明顯，但與最佳條件相比，使用高于9.3mm的高度導(dǎo)致%CV顯著增加高達(dá)3%。

圖3：焦距設(shè)置對數(shù)據(jù)變化的影響

你知道嗎？
通過在具有EDR功能的BMG LABTECH微孔板讀板機上開始測量時選擇自動對焦，讀板機可以自動識別具有最強信號的樣本，并調(diào)整該孔的焦距。

你知道嗎？
BMG LABTECH的線上文檔庫包含各種各樣的應(yīng)用說明，這些說明突出了我們的微孔板讀板機上常用分析的性能，并為讀板機設(shè)置提供了建議，包括焦距。

如何在BMG LABTECH閱讀板機上調(diào)整焦距

在“開始測量”窗口中選擇測試程序后，可以調(diào)整BMG LABTECH讀板機的焦距。只需選擇一個要進(jìn)行焦點調(diào)整的樣品孔（或多個孔），選擇“新焦距”或“自動對焦”（如果可用），然后單擊“開始調(diào)整”按鈕。

正如你所看到的，將微孔板讀板機設(shè)置調(diào)整到適當(dāng)?shù)慕咕鄬τ讷@得最佳結(jié)果至關(guān)重要。然而，這樣做的先決條件是，必須將板上樣品孔的加樣體積差異保持在最低限度。

由于最佳焦距是根據(jù)一個樣品孔的加樣體積確定的，因此孔之間的體積差異，無論是由于移液誤差無意造成的，還是由于不同體積的移液有意造成的，都會改變結(jié)果。如以下示例中所強調(diào)的（圖4），即使孔之間的幾微升差異也會導(dǎo)致測量信號強度的顯著變化。

在本案例中，將不同體積（10至30μL）的10nM熒光基團(tuán)標(biāo)準(zhǔn)品分配到微孔板的不同孔中。在具有15μL樣品體積的孔上進(jìn)行焦點調(diào)節(jié)。隨后用獲得的設(shè)置測量所有樣品，并將測量數(shù)據(jù)相對于來自15μL孔的測量數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化。如圖4所示，在加樣量較低或較高的孔上使用15μL體積的最佳焦距將導(dǎo)致顯著偏差。即使樣品體積只有2.5μL的微小差異也會導(dǎo)致信號強度出現(xiàn)20%的偏差。在某些情況下，這甚至可能導(dǎo)致信號的增加，這是由于在具有更高樣品體積的孔中包含的分析物的總量更高。