快速流式細(xì)胞儀助力糖尿病相關(guān)血管并發(fā)癥的研究

糖尿病作為全球性的慢性疾病，其患者數(shù)量每年激增，并導(dǎo)致一定死亡率， 多與心血管異常有關(guān)，可引發(fā)嚴(yán)重肢體缺血和截肢。血管缺陷是由機(jī)體現(xiàn)有的血管系統(tǒng)惡化和血管生成障礙共同引起的。血管生成的主要調(diào)節(jié)因子之一是缺氧誘導(dǎo)因子（HIFs），其β亞基又稱(chēng)芳烴受體核轉(zhuǎn)運(yùn)子（aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator，ARNT），與糖尿病的發(fā)展和進(jìn)展有關(guān)。血管生成主要由內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)驅(qū)動(dòng)，整體和EC特異性ARNT缺失都與胚胎致死有關(guān)。內(nèi)皮細(xì)胞中的ARNT缺失加劇了糖尿病介導(dǎo)的缺血誘導(dǎo)血管生成損傷。在糖尿病背景下，ARNT在內(nèi)皮中的表達(dá)減少，可能解釋了為什么糖尿病是導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙和組織修復(fù)以及再生延遲的最大危險(xiǎn)因素，并最終表現(xiàn)為嚴(yán)重的血管并發(fā)癥。

 

來(lái)自美國(guó)芝加哥大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)，對(duì)內(nèi)皮芳烴受體核轉(zhuǎn)運(yùn)體（ecARNT）介導(dǎo)2型糖尿病小鼠外周血缺血血管生成反應(yīng)進(jìn)行研究，相關(guān)研究成果于2021年6月發(fā)表在Frontiers in Cell and Developmental Biology上。這篇文章研究了在2型糖尿病小鼠中， ecARNT的表達(dá)下降與血管生成缺陷之間的關(guān)系。研究人員采用了一種攜帶可誘導(dǎo)的EC特異性ARNT敲除突變的小鼠模型（Arnt^△EC,ERT2），發(fā)現(xiàn)這種小鼠在非糖尿病和糖尿病條件下都出現(xiàn)了血流恢復(fù)受損的情況，但糖尿病動(dòng)物的損傷程度更大。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，通過(guò)siRNA介導(dǎo)的ARNT活性敲低可以減少在高葡萄糖條件下培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）中的管狀形成和細(xì)胞存活。Arnt^△EC,ERT2突變還降低了小鼠骨骼肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞（MVECs）的細(xì)胞存活率，同時(shí)增加了活性氧（ROS）的產(chǎn)生。當(dāng)這些細(xì)胞在高糖濃度下接受ROS抑制劑處理時(shí)，Arnt^△EC,ERT2 MVECs的存活率增加。這表明在高糖條件下，ARNT保護(hù)細(xì)胞免受ROS產(chǎn)生造成的損傷。

文章中有關(guān)細(xì)胞存活率統(tǒng)計(jì)采用細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定，并使用Moxi GO II 快速流式細(xì)胞儀(Orflo Technologies)進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)方案如下：轉(zhuǎn)染ARNT-siRNA或?qū)φ誷iRNA后，HUVECs (1.1 × 10⁵)在不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基中孵育6小時(shí)，然后在高糖（HG）或正常葡萄糖（NG）培養(yǎng)基中孵育。使用0.25%胰蛋白酶從皿中收集HUVECs，并使用Moxi GO II 每24小時(shí)計(jì)數(shù)一次，連續(xù)計(jì)數(shù)3天。HG或NG處理48小時(shí)后，通過(guò)細(xì)胞凋亡測(cè)定HUVECs和MVECs的細(xì)胞存活率。用PBS洗滌細(xì)胞，使用Annexin V和PI試劑盒(Orflo Technologies)FITC偶聯(lián)的Annexin V和PI進(jìn)行雙染色，繼而通過(guò)Moxi GO II 進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。

圖1 在高糖(HG)或正常培養(yǎng)基(NG)條件下，ARNT表達(dá)對(duì)細(xì)胞活力和細(xì)胞活性氧(ROS)產(chǎn)生的影響。
(A)如所示，HUVECs中存在HG或NG培養(yǎng)基時(shí)，處理組用siRNA轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)ARNT敲低，對(duì)照組為control-si。(B)高糖條件下，處理組Arnt^△EC,ERT2 和對(duì)照組Arnt^fl/fl WT小鼠分離的MMVECs中ROS水平。(C) Mito-TEMPO抑制ROS對(duì)細(xì)胞活力的影響。從處理組Arnt^△EC,ERT2 和對(duì)照組Arnt^fl/fl WT小鼠中分離的MMVECs在HG培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，然后給予0.5μM的Mito-TEMPO 24 h。使用Moxi GO II測(cè)定細(xì)胞活力。數(shù)據(jù)以mean±SEM表示(每組n = 6-8)。*P ＜0.01. (D)內(nèi)皮細(xì)胞ARNT在糖尿病血管生成中的作用示意圖。
 

文章中采用Orflo Technologies公司的Annexin V和PI試劑盒以及Moxi GO II快速流式細(xì)胞儀，進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)，區(qū)分活細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞，并定量分析各自所占比例。對(duì)誘導(dǎo)的EC特異性ARNT缺失HUVECs以及MVECs的細(xì)胞活力進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。從圖1中可以看出，通過(guò)siRNA介導(dǎo)的ARNT活性敲低，能夠降低在高葡萄糖條件下培養(yǎng)的HUVECs管狀結(jié)構(gòu)形成和細(xì)胞存活率。Arnt^△EC,ERT2突變會(huì)降低MVECs的存活率，同時(shí)增加活性氧（ROS）的產(chǎn)生。當(dāng)這些細(xì)胞在高葡萄糖濃度下接受ROS抑制劑處理時(shí)，其存活率得到了提高。本研究首次建立了ecARNT與糖尿病血管生成受損之間的聯(lián)系，并證明了在糖尿病中，ecARNT缺乏通過(guò)增強(qiáng)ROS的負(fù)面作用來(lái)加劇血管生成受損的作用機(jī)制。

Moxi GO II快速流式細(xì)胞儀

傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀設(shè)備體積大，構(gòu)造復(fù)雜，價(jià)格昂貴，通常作為平臺(tái)產(chǎn)品儀器使用。儀器操作復(fù)雜，維護(hù)繁瑣，對(duì)操作者要求較高，往往需要進(jìn)行專(zhuān)業(yè)操作培訓(xùn)，具備專(zhuān)業(yè)知識(shí)技術(shù)才能使用。同時(shí)平臺(tái)產(chǎn)品排隊(duì)周期長(zhǎng)，限制了科研人員的使用。

 

針對(duì)這種情況，美國(guó)Orflo Technologies公司將行業(yè)公認(rèn)的細(xì)胞計(jì)數(shù)和大小測(cè)量金標(biāo)準(zhǔn)——庫(kù)爾特原理（Coulter Principle）與熒光流式檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合，推出的新一代快速流式細(xì)胞儀——Moxi GO II，滿(mǎn)足了研究人員對(duì)細(xì)胞凋亡檢測(cè)的需求。

 

美國(guó)Orflo Technologies公司是一家非常專(zhuān)業(yè)的細(xì)胞分析儀器研發(fā)和制造企業(yè)，擁有多項(xiàng)專(zhuān)利技術(shù)，產(chǎn)品以庫(kù)爾特原理的高精細(xì)胞計(jì)數(shù)儀和超快流式細(xì)胞儀為主。作為中國(guó)地區(qū)獨(dú)家代理，環(huán)亞生物科技有限公司全權(quán)負(fù)責(zé)Orflo Technologies產(chǎn)品在中國(guó)地區(qū)的推廣、銷(xiāo)售，為廣大用戶(hù)提供專(zhuān)業(yè)的技術(shù)咨詢(xún)和產(chǎn)品服務(wù)。

環(huán)亞生物，生命科學(xué)產(chǎn)品全國(guó)性代理商，不斷把國(guó)外頂級(jí)的創(chuàng)新產(chǎn)品引入中國(guó)。環(huán)亞生物具備完善的公司運(yùn)營(yíng)、產(chǎn)品管理、營(yíng)銷(xiāo)、售前技術(shù)支持和售后維修體系。
    
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https://doi.org/10.3389/fcell.2021.691801

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