RNA-seq應用：LncRNA Nron缺失可減輕小鼠飲食引起的肥胖和肝脂肪變性

研究結果
1. NKO 小鼠免受飲食引起的肥胖
NKO小鼠和WT野生型小鼠都接受HFD和SCD（標準對照飲食）喂養(yǎng)，SCD喂養(yǎng)組中沒有體重差異，而與WT小鼠相比，HFD喂養(yǎng)的NKO小鼠體重明顯減少（圖1A、1B）。CT掃描進行的身體成分分析也表明，NKO小鼠的脂肪量較少，SCD喂養(yǎng)的內臟脂肪和和HFD喂養(yǎng)的內臟脂肪、皮下脂肪均減少（圖1C、1D）。為了更好地了解肥胖減少的原因，研究人員對僅接觸HFD 6 周（體重出現(xiàn)差異之前）的小鼠進行了全身能量代謝研究。不同基因型之間的食物攝入量和運動活動沒有差異（圖 1E、1F）。在HFD喂養(yǎng)條件下，NKO小鼠的總耗氧量明顯高于WT幼崽(圖1G、1H)，呼吸交換比(RER)降低(圖1I、1J)，表明脂肪酸被用作優(yōu)先的能量底物。此外，NKO小鼠在HFD喂養(yǎng)期間計算的每日能量消耗也增加(圖1K和1L)。
 

2. NKO小鼠具有更高的葡萄糖耐受性和胰島素敏感性
對葡萄糖的穩(wěn)態(tài)測定發(fā)現(xiàn)，在HFD喂養(yǎng)6周后，在兩組之間的體重沒有差異的情況下，NKO小鼠表現(xiàn)出更好的葡萄糖和胰島素耐受能力（圖2A- 2D）。NKO小鼠的 HOMA-IR 值（胰島素抵抗指標）也較低（圖2E）。此外，還評估了肝臟中的胰島素信號傳導，發(fā)現(xiàn)NKO小鼠中胰島素誘導的AKT磷酸化比WT小鼠更明顯增加，但mTOR/S6K磷酸化沒有相應增加（圖2F、2G） 。
 

3. NKO小鼠不受HFD誘導的肝脂肪變性
對小鼠的血清和肝臟脂質代謝測定結果發(fā)現(xiàn)，HFD喂養(yǎng)條件下NKO小鼠血清游離脂肪酸 (FFA)水平顯著低于WT小鼠。但是，血清甘油三酯（TG）和膽固醇水平沒有顯著差異（圖3A-3C）。值得注意的是，肉眼觀察、油紅O染色和肝脂質定量顯示，HFD條件下，NKO小鼠的肝臟脂肪變性較少，肝臟中TG的積累減少（圖3D-3E、3H）。肝臟游離脂肪酸和膽固醇含量無明顯變化（圖3F、3G）。此外，NKO小鼠的ALT水平顯著降低（圖3I）。但是，通過 F4/80 或 c-caspase3 染色的組織學分析，沒有觀察到肝臟炎癥和細胞凋亡的差異（圖3J 、3K）。
 

4. 小鼠肝臟RNA-Seq和代謝組學
為了深入了解 NKO對肝脂肪變性保護作用的分子過程，對HFD喂養(yǎng)的WT和NKO小鼠進行mRNA-seq測序，分析得到403個下調基因，304個上調基因。脂質代謝通路在NKO肝臟中顯富集（圖 4A 和 4B）。由于NKO肝臟中TG和FFA沉積減少，重點研究了與脂肪酸和甘油脂代謝相關的基因表達的變化，發(fā)現(xiàn)參與脂肪形成的基因（AcacB、FASN、SCD1、Elovl6）在NKO肝臟中都比WT組下調(圖4C)。QPCR證實了這一結果（圖 4D）。然而，與FA攝�。–D36、Fabp1、Fatp2）、FA氧化(CPT1a、Acox1、Cyp4a10)以及炎癥(Tnf-α, Il1-β, and Il-6)相關的基因在兩組中的表達沒有差異（圖4E）。但Nron缺失既不影響p65的磷酸化，也不影響炎癥基因的表達（圖4D）。相比之下，觀察到NKO肝臟中 AMPK的激活增加，SREBP-1靶基因FASN 和SCD1 的蛋白質水平持續(xù)下降（圖 4F）。另外，觀察到HFD喂養(yǎng)的NKO小鼠肝臟中的中鏈和長鏈�；�肉堿顯著減少（圖 4G)，血清β-羥基丁酸的增加也明顯改善了FAO（圖4H）。QPCR結果顯示，與 WT 小鼠相比，NKO 小鼠肝臟中的Fgf21有所增加（圖 4I）。HFD 喂養(yǎng)期間，兩組的血清中FGF21表達逐漸增加，但在NKO小鼠中FGF21水平在在整個16 周HFD喂養(yǎng)期間維持在較高水平（圖 4J），相反，在基礎條件下，WT 和 NKO 小鼠的脂聯(lián)素和瘦素血清水平沒有差異。本研究中，證明 NKO 小鼠肝臟中的 FGF21 蛋白水平肯定升高，而脂肪組織中的FGF21蛋白水平沒有變化（圖 4K）。為了測試這些效應是否是細胞自主的，從 WT 和 NKO 肝臟中分離出原代肝細胞，NKO 肝細胞中FGF21 的蛋白水平隨著 AMPK 激活和 SREBP-1/FASN抑制而升高，但當FGF21 被敲低時，這種影響被消除（圖4L）。同樣，油紅O染色和TG定量顯示，F(xiàn)GF21敲低完全消除了Nron缺失對培養(yǎng)肝細胞脂質沉積的保護作用(圖4M和N)。
 

5. Nron與KPNB1相互作用調節(jié)PER2/Rev-Erbα/FGF21
據報道，Nron 與幾種不同的蛋白質成分相互作用，這些蛋白質成分參與翻譯后修飾和信號轉導，或參與蛋白質周轉和核質運輸，或充當支架蛋白（圖 5A）。作者首先通過功能缺失實驗研究了這些蛋白在FGF21表達中的作用，發(fā)現(xiàn)NKO細胞中FGF21的誘導被KPNB1敲低所抵消(圖5B)。此外，Nron與KPNB1的相互作用通過RNA Pull-down（圖5C）和RNA免疫沉淀測定（圖5D）進行了驗證。幾個核心生物鐘基因（Per1、Per2、Rev-Erbα）在NKO小鼠的肝臟中下調，QPCR驗證結果一致（圖5E）。接下來用肝臟原代細胞確定了晝夜節(jié)律成分的蛋白質水平（圖5G）。用免疫熒光測定證實了NKO 肝細胞中PER2的顯著核定位（圖5H）。此外，研究還發(fā)現(xiàn)在免疫共沉淀分析中PER2與KPNB1相互作用，并且這種相互作用在NKO肝細胞中顯著增加（圖5I）。相反，Period家族的另一個成員PER1不與KPNB1 結合（圖5J）。相應地，KPNB1的敲低完全逆轉NKO肝細胞中PER2增加的核積累（圖5K）。PER2的敲低消除了NKO肝細胞中FGF21的誘導，并且Rev-Erbα的聯(lián)合敲低恢復了FGF21水平，而Nron OE減少了FGF21的表達，并且Rev-Erbα敲低完全逆轉了抑制（圖5L、5M）。Fgf21熒光素酶報告結果顯示，與WT組相比，NKO細胞的熒光素酶活性顯著增加(圖5N)。根據研究結果，作者認為Nron通過KPNB1/PER2/REV-Erbα軸調節(jié)FGF21的表達。接著，還檢測了Nron對核心clock基因表達的影響，發(fā)現(xiàn)Nron缺乏并不影響clock和Bmal的節(jié)律性(圖50)，這與的RNAseq結果一致。
 

6. Nron缺失可通過FGF21減輕肝臟脂肪變性
為了確定NKO小鼠的表型可能是FGF21誘導肝臟的結果，制備了攜帶FGF21 shRNA的AAV8(AAV8-shFGF21)，然后將其靜脈注射到WT和NKO小鼠體內，以誘導肝臟中FGF21的敲除（KD）。KD肝臟中FGF21的含量降低了70%以上(圖6A)。值得注意的是，即使在FGF21被敲除的情況下，接受HFD喂養(yǎng)的NKO小鼠的體重和脂肪質量也低于WT小鼠(圖6B、6C)。然而，NAFLD的改善完全減弱(圖6D-6I)，表明FGF21依賴對肝臟脂肪變性的保護作用。同樣的，當FGF21被擊倒時，NKO小鼠AMPK的激活和對脂肪生成的抑制完全被取消(圖6J和L)。
 

7. Nron缺失促進脂肪細胞脂解
為了更清楚地闡明Nron對能量代謝的作用機制，對脂肪組織進行研究，組織學分析和細胞大小定量顯示，HFD喂養(yǎng)的NKO小鼠的表皮脂肪細胞比對照組小(圖7A-7C)，NKO小鼠的脂肪組織巨噬細胞和冠狀結構的數量少于WT小鼠(圖7A、7D)。此外，對EPWAT中代謝中間產物的分析顯示，NKO小鼠中與三羧酸(TCA)循環(huán)相關的代謝物急劇增加，包括終末代謝物琥珀酸和富馬酸，此外，還觀察到環(huán)腺苷一磷酸(cAMP)水平升高(圖7E和7F)。接著使用p-(Ser/Thr) PKA底物抗體來檢測脂肪PKA底物，并證明在NKO小鼠的epiWAT中PKA活性確實增強（圖7G）。NKO 和 WT 外植體之間的基礎甘油和FFA釋放沒有差異，但NKO小鼠的epiWAT中ISO刺激的甘油和 FFA 釋放顯著增加。相反，胰島素對脂肪分解的抑制作用不受影響（圖7I、7J）。從NKO和 WT小鼠中分離出附睪SVF，并刺激其分化為脂肪細胞，然后進行脂肪分解測定。Nron 敲除不影響脂肪分化（圖7K 和L）。在分化的NKO脂肪細胞中，ISO刺激的甘油和FFA釋放仍然增加（圖7M和N），同時伴隨著PKA活性和HSL磷酸化的增強（圖7O），表明 Nron 具有脂肪分解的細胞自主功能。當 FGF21 被敲低時，在NKO小鼠中觀察到的脂肪分解增加被保留（圖7P）。相比之下，盡管血清FGF21水平與對照組相比顯著增加，LiNKO小鼠沒有表現(xiàn)出脂肪分解改變（圖7Q）。
 

8、Nron 缺失增加脂肪組織中的脂質周轉
使用HFD喂養(yǎng)的WT和NKO小鼠進一步進行EpiWAT的微陣列轉錄組分析。KEGG通路分析結果表明脂質和碳水化合物代謝通路顯著富集（圖8A-8D），并通過QPCR對結果進行驗證（圖8E和F）。并發(fā)現(xiàn)上調的基因主要與FA合成(Acc1、Acsl1、Fasn、Scd1和Elovl6)、甘油三酯合成(Gpd1、Gpd2、Dgat1)、檸檬酸-丙酮酸循環(huán)(Acly、Me1)和TCA循環(huán)(Pdha1、Pdhb、Dlat、Cs、Aco1)相關（圖8G），另外PCX和GPD1在NKO小鼠中顯著上調(圖8E-G)，G3P/DHAP比率顯著增加(圖8H)、有氧能力的指標檸檬酸合成酶(CS)的活性也增加(圖8I)。為了進一步評估脂肪組織的耗氧量，對飼喂高脂飼料6周的小鼠的WAT外植體進行了細胞外流量分析結果發(fā)現(xiàn)，NKO小鼠的脂肪組織顯示出比WT小鼠顯著更高的耗氧率(OCR)(圖8J)，表明線粒體呼吸能力增加。
 

參考文獻：
Please cite this article as: B. Liu, Y. Zhong, D. Huang, et al., LncRNA Nron deficiency protects mice from diet-induced adiposity and hepatic steatosis, Metabolism (2023), https://doi.org/10.1016/j.metabol.2023.155609