間充質(zhì)干細(xì)胞MSCs在不同分離方法下獲得率的評(píng)判標(biāo)注

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是來源于中胚層的多能成體干細(xì)胞，廣泛存在于臍帶、骨髓、脂肪、牙髓、月經(jīng)血等組織，體外培養(yǎng)可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等多種類型的細(xì)胞。

圖1 The Mesengenic Process（圖片來源于文獻(xiàn)，僅供學(xué)習(xí)參考用）

 

MSCs具有自我更新能力和多向分化潛能，能夠釋放出許多具有抗凋亡、免疫調(diào)節(jié)、促血管生成等功能的生物活性因子，可刺激組織器官再生，并且低水平表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體（MHC）Ⅰ類分子，不表達(dá)MHC-Ⅱ類分子，不易激活T細(xì)胞的免疫反應(yīng)，具有低免疫原性。這些特點(diǎn)和功能使MSCs成為細(xì)胞治療的首選，美國臨床信息公示數(shù)據(jù)庫顯示，截止今年9月份，共有1583項(xiàng)MSCs的臨床實(shí)驗(yàn)，研究主要集中于心血管疾病、新冠肺炎、骨關(guān)節(jié)損傷、自身免疫性疾病等。

圖2 MSCs研究者分布和MSCs研究熱點(diǎn)

 

隨著MSCs的研究如火如荼，不同的分離方法、營養(yǎng)體系隨之而來，如何評(píng)判不同分離方法的MSCs獲得率成為了一個(gè)難題，為了解決這個(gè)問題，2006年，國際細(xì)胞治療學(xué)會(huì)的間充質(zhì)和組織干細(xì)胞委員會(huì)提出了定義人類MSCs的最低標(biāo)準(zhǔn)。

 

1、MSCs在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下必須具有塑料粘附性

 

MSCs具有異質(zhì)性，不同物種，不同組織來源大小有所差異，例如貓脂肪來源MSCs臍帶來源MSCs小，所以無法單一的從外觀判定MSCs，但是幾乎所有的MSCs都是貼壁生長，具有較強(qiáng)的貼壁能力，多數(shù)MSCs呈纖維細(xì)胞樣生長，呈梭形或不規(guī)則三角形，胞質(zhì)向外伸出突起。傳代后細(xì)胞呈旋渦狀排列生長。

圖3 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（圖片來源于網(wǎng)絡(luò)，僅供學(xué)習(xí)參考用）

 

2、特異性表面抗原（Ag）的表達(dá)

 

通過流式細(xì)胞術(shù)測量，95%的MSCs群體必須表達(dá)CD105、CD73和CD90。此外，這些細(xì)胞必須缺乏CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79a或CD19和HLA II類的表達(dá)（5/2%陽性）。

 

表1 MSCs特異性表面抗原的表達(dá)指標(biāo)

Phenotype	Positive (≥95%)	Negative (≤ 2%)
	CD105	CD45
	CD73	CD34
	CD90	CD14或CD11b
		CD79a或CD19
		HLA II

 

3、在體外具有分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞的能力

 

三系分化能力是MSCs最獨(dú)特的鑒定MSCs的方法，向成骨細(xì)胞的分化可以通過用茜素紅染色或von Kossa染色來證明，向脂肪細(xì)胞分化最容易通過油紅O染色來證明，成軟骨細(xì)胞分化通過阿利辛藍(lán)或免疫組織化學(xué)染色來證明。

圖4 人MSCs成骨分化誘導(dǎo) abs9453

圖5 人MSCs成脂分化誘導(dǎo) abs9454

圖6 人MSCs成軟骨分化誘導(dǎo) abs9455

 

三系分化小問答：

 

1、如何解決成骨分化后細(xì)胞極易脫壁的現(xiàn)象？
1）試劑盒內(nèi)含有包被液，可在鋪板前使用；
2）分化時(shí)細(xì)胞匯合度不易過高，請(qǐng)按照說明書指示；
3）多孔樣品換液時(shí)應(yīng)盡量分批迅速，避免細(xì)胞表面干涸，加液時(shí)手法輕柔，不能直接沖擊皿底，換液時(shí)培養(yǎng)基必須復(fù)溫；
4）誘導(dǎo)過程中更換培養(yǎng)液時(shí)不要清洗，誘導(dǎo)結(jié)束后清洗時(shí)一定要輕柔，避免劇烈晃動(dòng)。

2、成脂分化時(shí)細(xì)胞形態(tài)變差？
1）成脂時(shí)細(xì)胞匯合度一定要達(dá)到90%左右；
2）若用完全誘導(dǎo)培養(yǎng)基B時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)變差，可以根據(jù)具體情況提前更換為完全誘導(dǎo)培養(yǎng)基C；
3）誘導(dǎo)過程中無需清洗，誘導(dǎo)結(jié)束后清洗時(shí)一定要輕柔，避免劇烈晃動(dòng)。

3、成軟骨誘導(dǎo)后軟骨球不懸浮或者軟骨球碎裂？
1）細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)離心時(shí)，推薦220g離心5min，具體情況可以調(diào)整，以細(xì)胞聚團(tuán)為準(zhǔn)，離心力過大軟骨球不易懸浮，過小軟骨球表面易分散；
2）誘導(dǎo)后24 小時(shí)內(nèi)避免搖動(dòng)細(xì)胞沉淀，以確保形成個(gè)團(tuán)塊。離心管需使用聚丙烯材質(zhì)無菌管；
3）注意開關(guān)培養(yǎng)箱門時(shí)動(dòng)作要輕柔，不要震動(dòng)。

4、軟骨球是否可以做冰凍切片？
可以，做冰凍切片時(shí)固定后可以用蔗糖梯度脫水，若不及時(shí)切片染色，需用鋁箔紙包裹，保存在-80℃。