微生物實驗室菌種管理及保存方法詳解

微生物實驗室如果從事致病菌檢測、培養(yǎng)基質(zhì)控驗收、方法驗證等相關(guān)工作，就應(yīng)該備有標(biāo)準(zhǔn)菌株。實驗室需對使用的標(biāo)準(zhǔn)菌株進行規(guī)范性管理，以便有效地、安全地使用，保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

一、實驗室應(yīng)建立菌種管理制度

內(nèi)容包括菌種申購、保管、領(lǐng)用、使用、傳代、存儲等方面的內(nèi)容，標(biāo)準(zhǔn)菌種申購應(yīng)由專人申購，保管由專人雙人雙鎖管理，領(lǐng)用及使用應(yīng)填寫記錄，使用時應(yīng)對菌種進行純度及生化特性進行菌種核查驗證并記錄，存儲應(yīng)有專門的冰箱、超低溫冰箱進行存儲，使用完的菌株應(yīng)按要求銷毀處理。

二、實驗室根據(jù)需求購買相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)菌株

購買標(biāo)準(zhǔn)菌株應(yīng)從有資質(zhì)的機構(gòu)進行購買，到貨的標(biāo)準(zhǔn)菌株應(yīng)包括菌種證明，后面附有菌種質(zhì)控報告。收到菌種時應(yīng)仔細(xì)閱讀菌種證明，核實到貨的菌種與申購的是否一致，包裝是否完整，注意保存條件及有效期，并將菌種放置相應(yīng)的條件下進行儲存(一般在活化前儲存于4℃冰箱中)。核實后及時填寫菌種清單，菌種清單應(yīng)包括菌種名稱、菌種編號、到貨日期、儲存條件、購買數(shù)量、領(lǐng)用日期、領(lǐng)用人、銷毀日期等。

三、實驗室建立菌種傳代圖

菌種傳代圖記錄簡潔清晰，記錄內(nèi)容包括菌種名稱、菌種編號、到貨日期、菌種完整性、菌種活化日期、活化方法(主要包括活化使用的培養(yǎng)基及培養(yǎng)溫度)、活化數(shù)量、保藏條件，保存數(shù)量、領(lǐng)用人、傳代日期、傳代數(shù)量、菌種用途、銷毀日期等。菌種在活化后及每次使用時都應(yīng)對菌株純度、菌落形態(tài)(在選擇培養(yǎng)基上的典型菌落)、生化特性(如氧化酶試驗、三糖鐵試驗等)、表型分析(用VITEK 鑒定)進行核查并記錄，以保證菌種使用的有效性。

四、菌種保藏方法

菌種保藏方法可依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)SN/T2660-2010《食品微生物實驗室菌種保藏方法》進行保存。建議實驗室購買-80℃超低溫冰箱，選擇甘油保存法，甘油保存方法操作方便，保存時間較長。菌株使用過程中應(yīng)在生物安全柜中進行，遵循無菌操作以防菌種污染。使用完的菌種應(yīng)按生物安全要求，在121℃高壓滅菌30min，并做好菌種銷毀記錄。

實驗室菌株管理是小事，然而卻是重要的事。他直接影響著實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，不容忽視哦!

為了避免微生物死亡、污染，保持其原有性狀基本穩(wěn)定，便于研究和使用，需要用到菌種保藏技術(shù)。以下介紹一些常見的菌種保存的方法。

1、低溫冷凍保藏法

該方法適合大多數(shù)需要長期保存的微生物，病毒等。原理為在超低溫環(huán)境下時，微生物代謝活動停止，一般溫度越低效果越好。

使用凍存管對菌種進行保存，同時需要保護劑，一般使用甘油、脫脂羊粉或者二甲亞砜等保護劑。講含有菌種的凍存管置于-60~-80℃冰箱中冷凍保存。

2、液體石蠟保藏法

液體石蠟保藏法適用于一些不能分解石蠟的菌類，例如酵母菌、芽孢桿菌屬、青霉屬、曲霉屬等，一些細(xì)菌和真菌并不適合用該方法進行保存。液體石蠟法使用液體石蠟覆蓋，微生物代謝被抑制，菌種老化推遲。石蠟法可以防止氧氣進入，使得需氧菌無法繼續(xù)生長，同時若培養(yǎng)基水分蒸發(fā)，容易導(dǎo)致細(xì)菌死亡，石蠟法可防止培養(yǎng)基水分蒸發(fā)，延長菌種保存時間。
 
無菌條件下將滅菌的液體石蠟注入剛培養(yǎng)好的斜面培養(yǎng)物上，液面高出斜面頂端1cm~2cm，加膠塞并用固體石蠟封口，使菌種與空氣隔絕。將注人石蠟油的菌種斜面直立存放于低溫（4℃~6℃）干燥處或室溫下保存。

3、冷凍干燥保藏法

該方法適合大多數(shù)微生物的保存，但不適用于不產(chǎn)孢子的絲狀真菌。冷凍干燥保藏法是在低溫、干燥、缺氧條件下保藏菌種。即在低溫條件下快速地將菌種凍結(jié)，使微生物保持完整，然后減壓抽直空使冰升華直至脫水干燥，并在直空狀態(tài)密封隔絕空氣，使微生物代謝活動停止，得以長期保藏。

按照一定配方配置保護劑加入安瓿管，然后再加入菌種制備成菌懸液。先將安瓿管進行預(yù)凍存至-15~-20℃，然后用冷凍真空干燥機對安瓿管進行干燥，并將安瓿管進行熔封。低溫避光保存。

4、沙土管保藏法

該方法適合用于產(chǎn)孢類放線菌、芽孢桿菌等的保存，不適合以菌絲發(fā)育為主的真菌和病原性真菌的保藏。使用細(xì)沙土創(chuàng)造干燥條件，使那些能夠產(chǎn)生孢子或芽孢的微生物在干燥環(huán)境中的代謝活動減緩，抑制其繁殖速度，且抵抗力強不易死亡。該方法能減少菌株突變，延長存活時間。
將河、海沙用60目過篩，棄去大顆粒及雜質(zhì)，再用80目過篩，去掉細(xì)沙。用吸鐵石吸去鐵質(zhì)，放入容器中用10%鹽酸浸泡，如河沙中右機物較多可用20%鹽酸浸泡。24h后倒去鹽酸，用自來水浸泡數(shù)次至中性，將沙子烘于或曬干。另取未被污染的地表以下十壤用100日討篩，自來水洗至中性，烘干。按沙：土=2：1混合均勻，分裝人安瓿管或小試管中，高度為1cm左右，塞好棉塞，121℃高壓滅菌1h~1.5h，或常壓間歇滅菌3次、每天每次16。在50℃以下烘干（溫度不宜過高，否則土壤有機質(zhì)被高溫分解后，產(chǎn)生有害物質(zhì)，影響菌種性能），經(jīng)檢查無微生物生長方可使用。

之后制備菌懸液并將菌懸液加入沙土管中。講含有菌懸液的沙土管放入真空干燥器中進行真空干燥。使用火焰封融管口，存放于低溫（4℃~10℃）或常溫干燥處，定期檢查活力及雜菌情況。

5、瓷珠保存法

市面上通常有便于使用的瓷珠保存管成品，用于低溫保存菌種。瓷珠保存管通常由一根凍存管，以及內(nèi)部的保存液和瓷珠構(gòu)成。表面凹凸的瓷珠用于細(xì)菌的吸附和保存�？稍�-20℃或-80℃下對菌種進行長期保存。不管是在保存還是在復(fù)蘇接種時，操作都更加簡便。

從平板上刮取細(xì)菌純培養(yǎng)物于菌種保存管中，大致配置成3-4個麥?zhǔn)蠞舛�。搖晃使得細(xì)菌乳化，將保存液洗干凈后擰緊保存管，低溫凍存。