精調(diào) Piezo1 表達和活性可確保骨骼肌肌發(fā)生過程中高效的成肌細胞融合

骨骼肌是人體中最大的肌肉組織，由有絲分裂后的多核肌纖維構(gòu)成。肌肉干細胞，也被稱為衛(wèi)星細胞（SCs），是骨骼肌中位于肌纖維和基膜之間，當(dāng)受到外界刺激導(dǎo)致肌細胞損傷時，它們被激活形成成肌細胞，并具有增殖和分化能力，能夠修復(fù)受損的肌纖維，并與原有的肌細胞進行融合重建肌肉纖維，骨骼肌得到再生。因此，成肌細胞融合機制的改變會對再生效率和整體肌肉功能和健康產(chǎn)生深遠的影響。決定成肌細胞融合的一個重要過程是機械感受，但這如何在肌肉中調(diào)節(jié)仍然在很大程度上是未知的。

機械敏感性（MS）離子通道是指一類感受細胞膜表面應(yīng)力變化，實現(xiàn)胞外機械信號向胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的通道。Piezo1和Piezo2首先被確定為哺乳動物細胞中的力傳感器。Piezo1是機械敏感性的非選擇性陽離子通道，對Na+、K+、Ca2+ 和 Mg2+ 全部滲透，但更偏向Ca2+。Ca2+ 調(diào)節(jié)在骨骼肌的保持和修復(fù)中起著至關(guān)重要的作用，因此，在開發(fā)肌營養(yǎng)不良癥（肌肉萎縮癥）的治療干預(yù)措施時，了解Piezo1的功能可能至關(guān)重要。

在日本豐橋創(chuàng)造大學(xué)健康科學(xué)學(xué)院、英國倫敦國王學(xué)院蘭德爾細胞和分子生物物理中心等團隊的一項研究中，分析了Piezo1在骨骼肌肌發(fā)生中的作用，重點關(guān)注肌肉分化及其在拉伸誘導(dǎo)的原代成肌細胞來源的肌管 Ca2+ 內(nèi)流中的作用。研究成果發(fā)表在 Cells 期刊題為“Fine-Tuning of Piezo1 Expression and Activity Ensures Efficient Myoblast Fusion during Skeletal Myogenesis”。
 

首先，為了研究Piezo1在肌源性進展過程中的表達水平，利用小鼠快趾長伸�。‥DL）和慢比目魚�。⊿OL）肌肉衛(wèi)星細胞（SC）來源的原代成肌細胞（圖1 a）。在SOL來源的成肌細胞中，Piezo1表達在24小時后迅速增加，表明Piezo1在慢肌肉發(fā)生中的早期功能。與EDL來源的成肌細胞相比，Piezo1在SOL來源的成肌細胞中在24小時和72小時的分化上調(diào)（圖1 b）。因此，Piezo1表達在成肌細胞分化期間增加。然而，在蛋白質(zhì)水平上發(fā)現(xiàn)EDL和SOL來源的肌管在同一水平上調(diào)Piezo1（圖1 c-e）。這可能是由于這些肌肉群之間的轉(zhuǎn)錄和翻譯差異。這些結(jié)果要求進一步研究Piezo1在EDL和SOL來源細胞中的積極作用。

Ca2+ 本身是肌肉收縮的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，也是肌肉形成和分化/融合過程中早期的重要調(diào)控。因此，鑒于Piezo1 mRNA在分化成肌細胞中的積累，實驗試圖評估Ca2+ 內(nèi)流（[Ca2+]i）的動力學(xué)在培養(yǎng)的肌管中對Piezo1活性的調(diào)節(jié)，將樣本分為兩組：給予Piezo1特異性siRNA（Piezo1-敲低）和給予Piezo1激動劑Yoda1（30μM），給藥前施加漸進拉伸，在最初的1分鐘休息時間（0%拉伸）后，拉伸量分別為3% 、6% 和9%，持續(xù)1分鐘，然后休息1分鐘。

在對照條件下（siRNA對照和無Yoda1），在機械拉伸時，[Ca2+]i 在EDL來源和SOL來源的肌管中與無拉伸（0%）對照組相比顯著增加。EDL來源的對照肌管，拉伸力超過3% 時顯示 [Ca2+]i 的顯著增加。與對照細胞（siRNA對照）相比，在 [Ca2+]i 響應(yīng)拉伸后Piezo1的減少被強烈抑制。[Ca2+]i 在EDL來源的肌管中被完全消除，6% 和9% 的拉伸都不會引起其顯著增加。同樣，在所有拉伸組中，SOL來源的肌管中Piezo1的減少顯示出 [Ca2+]i 的顯著降低，只有Piezo1敲低的肌管在 9% 的拉伸條件下顯示出 [Ca2+]i 的增加。因此，Piezo1對拉伸期間 Ca2+ 內(nèi)流至關(guān)重要。

Yoda1介導(dǎo)的Piezo1激活能夠降低其激活閾值。實驗發(fā)現(xiàn)，在拉伸（0%拉伸）之前，Yoda1施用的肌管已經(jīng)開始顯示出增強的 [Ca2+]i，3% 拉伸時，[Ca2+]i 顯著升高，這種 [Ca2+]i 的增加在高拉伸時持續(xù)存在。總之，Piezo1的表達和活性對肌肉功能中的Ca2+調(diào)節(jié)至關(guān)重要。
 

圖1 Piezo1表達在分化的SC來源的成肌細胞中增加。

Piezo1 表達在后期肌生成階段中達到峰值，它調(diào)節(jié)收縮期間的鈣內(nèi)流。然而，Piezo1 是否參與肌生成的早期階段尚不清楚。因此，評估了Piezo1 對增殖和肌生成開始的影響，發(fā)現(xiàn)Piezo1的敲低對EDL和SOL來源的成肌細胞的增殖速率沒有明顯影響，因此Piezo1對于肌肉細胞增殖是可有可無的。接下來，通過分析轉(zhuǎn)錄因子Myogenin （肌細胞生成素）的積累，研究了 Piezo1 的減少是否可以改變分化階段的入口。EDL來源或SOL來源的成肌細胞均未在Piezo1敲低和對照siRNA處理條件下顯示Myogenin -陽性細胞相對比例上的顯著差異，表明Piezo1不參與成肌細胞分化的發(fā)生。

成肌細胞融合需要廣泛的膜重塑和機械應(yīng)力，因此，評估了Piezo1抑制對肌管形成和成熟的影響。Piezo1的敲低導(dǎo)致成肌細胞融合的顯著減少，隨后阻礙了EDL和SOL來源的肌管的形成。EDL 和 SOL 來源的成肌細胞顯示融合蛋白Myomaker的表達降低，表明融合機制在分子水平上發(fā)生了改變。另一方面，Myomixer 蛋白的表達呈下降趨勢。此外，早期形成的肌管中Piezo1的敲低證實了融合指數(shù)的顯著降低�？傊�，Piezo1表達的失調(diào)降低了細胞融合到新的或現(xiàn)有的肌管中的能力。

Piezo1的敲低可減少成肌細胞融合并改變 Ca2+ 內(nèi)流。接下來，實驗評估了Piezo1激活的劑量依賴性效應(yīng)，對早期形成的肌管在一段時間內(nèi)經(jīng)受不同濃度的Yoda1（圖2）。Yoda1 的1分鐘處理顯著增強了細胞融合（圖2 a-d），然而，用最高劑量（100 μM）的Yoda1進行30分鐘的處理具有相反的效果，降低了融合指數(shù)，這表明必須精細調(diào)控Piezo1活性以實現(xiàn)有效的融合和肌管成熟。在孵育30分鐘時，EDL和SOL來源的肌管在30 μM Yoda1 下均顯示融合增加（圖2 b、d）。孵育 1 小時后，EDL和SOL來源的肌管在5、10 和30 μM Yoda1 處理下表現(xiàn)出更高的融合效率（圖2 b、d）。

在分子水平上，Yoda1給藥后EDL和SOL來源的肌管中的Piezo1表達增加。Myomaker表達在EDL和SOL來源的肌管中也與Piezo1上調(diào)平行，而Myomixer呈現(xiàn)無統(tǒng)計意義的增加�？傊�，數(shù)據(jù)表明，Piezo1活性的精細調(diào)控是分化動力學(xué)的關(guān)鍵步驟。

實驗注意到，誘導(dǎo)激活Piezo1似乎會影響肌管的大小，盡管增加了成肌細胞融合。為了解決這個問題，將這些樣本的肌管寬度（直徑）與DMSO對照比較。有趣的是，EDL和SOL來源的肌管與Yoda1處理時均顯示肌管寬度減小。綜上所述，Piezo1的過度激活使成肌細胞融合和肌管生長不平衡。
 

圖2 Piezo1 活化以肌管合胞體成熟為代價增加成肌細胞融合。

隨著成肌細胞融合，成肌分化需要廣泛的細胞重塑，先前的研究將Piezo1調(diào)節(jié)在細胞骨架穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用。最后，為了了解 Piezo1 是否有助于調(diào)節(jié)細胞骨架結(jié)構(gòu)，包括 F-肌動蛋白，實驗評估了 EDL 和 SOL 來源的肌管中成肌分化期間細胞骨架重組的程度。Piezo1敲低顯示F-肌動蛋白的積累顯著減少，表明Piezo1的降低會改變細胞骨架動力學(xué)。相比之下，F(xiàn)-肌動蛋白積累不受Piezo1過度激活的影響，這表明Piezo1可能不直接促進F-肌動蛋白重塑。與成肌細胞融合的改變一致，過度Piezo1的化學(xué)激活顯示EDL和SOL來源的肌管中的F-肌動蛋白顯著降低。這些發(fā)現(xiàn)表明，Piezo1表達和/或其激活狀態(tài)的失調(diào)會影響成肌細胞融合和肌肉分化過程中的細胞骨架組織。

總之，該研究中提供的數(shù)據(jù)表明，Piezo1通道存在于SC來源的成肌細胞和肌管中，但在后者中表達的比例更高。Piezo1的下調(diào)顯著降低了肌管形成、生長和成熟過程中的融合能力。相比之下，Piezo1活化增加了融合。未來研究肌管功能（完整性、Ca2+內(nèi)流、細胞骨架組織和融合）的變化是機械應(yīng)力的直接結(jié)果，應(yīng)該考慮對Piezo1的分析。在針對DMD等肌肉萎縮癥的治療策略的背景下，我們不僅必須解開Piezo1表達的時空調(diào)控，而且必須意識到該通道改變其Ca2+ 內(nèi)流閾值的能力。從藥學(xué)上講，像 Yoda1 這樣的小激活分子可能是有益的。然而，在考慮這些激動劑作為可行藥物之前，必須注意這些激動劑在體內(nèi)的半衰期和藥代動力學(xué)。Piezo1在骨骼肌維護和功能方面的重要性無疑將隨著新的研究而增長。此外，鑒于Piezo1在肌源性進展中的關(guān)鍵作用及其在衛(wèi)星細胞中的表達，Piezo1活性的改變可能與衛(wèi)星細胞病的發(fā)病機制有關(guān)。

參考文獻：Ortuste Quiroga HP, Ganassi M, Yokoyama S, Nakamura K, Yamashita T, Raimbach D, Hagiwara A, Harrington O, Breach-Teji J, Asakura A, Suzuki Y, Tominaga M, Zammit PS, Goto K. Fine-Tuning of Piezo1 Expression and Activity Ensures Efficient Myoblast Fusion during Skeletal Myogenesis. Cells. 2022 Jan 24;11(3):393. doi: 10.3390/cells11030393. PMID: 35159201; PMCID: PMC8834081.

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35159201/

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