PROTAC技術助力針對“不可成藥”癌癥基因靶點的藥物開發(fā)研究
•所謂“不可成藥（undruggable）”，常用來描述傳統(tǒng)藥物研發(fā)中那些因結(jié)構(gòu)和功能特征而難以成為用藥靶點的蛋白質(zhì)。
•最近，美國食品和藥物管理局（FDA）加速批準了一種用于治療NSCLC的KRAS抑制劑，KRAS就是“不可成藥”基因的一個典型例子。
•PROTAC技術可以成為開發(fā)針對“不可成藥”基因的有效療法的有力工具。
二十年前，在人類基因組計劃第一版發(fā)表后不久，霍普金斯和格魯姆（1）提出了“可成藥性”的概念。他們估計，在30,000個預測的人類蛋白質(zhì)編碼基因中，只有約15%有可能成為可利用的藥物靶點，這意味著其余85%的蛋白質(zhì)組被認為是無法用藥的�？茖W的進步使這兩類基因之間的區(qū)別越來越模糊，許多最初被認為無法用藥的基因?qū)嶋H上已經(jīng)成功地成為靶點（如BCL-2家族成員）。
好的治療靶點有哪些特征？
1. 功能/活性。必須從一系列疾病或癥狀的驅(qū)動因素中選擇潛在的靶蛋白。歷史上，典型的藥物靶點包括G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）、核受體、離子通道和酶，因為它們具有“活性”功能，更容易擊中。隨著時間的推移，具有不同功能的蛋白質(zhì)，如參與特定蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）的蛋白質(zhì)以及支架蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白越來越多地被視為潛在靶標（2）。一個隱患是，與疾病相關的蛋白質(zhì)通常在健康細胞和組織中具有非病理性活性。因此，一味抑制它們的功能可能會導致不必要的副作用。
2. 表達。與前述觀點一致，理想的候選蛋白質(zhì)不應普遍表達，因為當“功能障礙”主要定位于特定組織時，發(fā)生脫靶效應的風險較低�？紤]到藥物開發(fā)的主要瓶頸之一是脫靶效應，脫靶效應會導致與劑量相關的毒性和/或劑量有限的療效，因此這一點尤為重要。為了克服這一困難，大量研究人員致力于開發(fā)專門針對相關細胞的給藥策略（如基于抗體、肽、適配體的給藥策略）（3）。
3. 可及性。組織和細胞蛋白質(zhì)的表達部位也與治療藥物能否輕易到達有關。例如，血腦屏障使大腦相對難以進入。因此，任何試圖攻擊神經(jīng)元蛋白質(zhì)的嘗試都需要考慮這一障礙。此外，蛋白質(zhì)對特定藥物的可及性還取決于其在細胞水平的位置（如細胞表面、細胞質(zhì)、細胞核/其他細胞器、細胞外環(huán)境）。例如，治療性抗體可以到達蛋白質(zhì)的細胞外部分，而細胞內(nèi)靶點則需要能夠穿透細胞的小分子化合物。
4. 結(jié)構(gòu)。從歷史上看，當?shù)鞍踪|(zhì)具有疏水結(jié)合袋和/或--在酶的情況下--明確的活性位點，可以容納候選藥物時，蛋白質(zhì)就被認為是可藥用的。相反，信號分子、結(jié)構(gòu)蛋白等的活性通常依賴于蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用，因此依賴于其三級或四級結(jié)構(gòu)的變化。這種內(nèi)在的可變性和缺乏確定的溝槽使得識別潛在藥物的結(jié)構(gòu)和物理特征（如大小、極性等）變得更加困難。
5. 結(jié)合親和力。與酶抑制特別相關，它表示酶識別特定底物的能力：親和力越高，結(jié)合能力越強，即使底物濃度很低。對底物具有高親和力的酶是更棘手的藥物靶點，因為潛在抑制劑需要極高濃度（有時甚至是不可行的濃度）才能與底物競爭。
不可成藥的癌癥基因
癌癥是導致全球死亡的主要原因之一（4），因此開發(fā)有效的治療方法是藥物發(fā)現(xiàn)活動的主要目標之一。癌癥類型和病因的多樣性使得這項工作尤為復雜。在已發(fā)現(xiàn)的700個癌癥基因中，目前僅有約40個基因的治療方法獲得批準（5）。此外，大多數(shù)研究工作往往集中在一組有限的“易藥”蛋白上（如HER2、EFGR、ALK、PD-1/PD-L1、雌激素受體或雄激素受體），因此，對于同一靶點，無論其在癌癥發(fā)生或發(fā)展中的實際發(fā)生率如何，都有多種FDA批準的藥物可用。例如，雖然“僅”在3%-5%的非小細胞肺癌中發(fā)現(xiàn)的ALK基因重排有五種已獲批準的治療方法（5,6），但絕大多數(shù)最常見的癌基因改變直到最近仍被認為是“不可成藥”的。
RAS、MYC和TP53就是典型的例子。事實上，RAS是癌癥中最常見的突變癌基因，MYC是最常見的擴增癌基因，而TP53則是最常見的突變和/或刪除腫瘤抑制基因（5）。這些基因突變是如此常見，以至于在任何人類癌癥中都有可能發(fā)現(xiàn)其中至少一種基因突變。不過，上一段中提到的幾個特征也適用于這些蛋白質(zhì)。例如：
•它們表達廣泛，對細胞的正常功能起著關鍵作用，因此脫靶風險很高。
•它們位于細胞內(nèi)部（尤其是P53和c-Myc），因此更難到達。
•它們沒有一個明確的口袋，潛在的低分子量藥物無法與之結(jié)合。
•c-Myc是一種內(nèi)在無序蛋白（IDP），具有擴展的非結(jié)構(gòu)化表面，因此缺乏常規(guī)藥物的靶“熱點”。
•P53和MYC沒有酶活性，因此不能使用催化抑制劑。
•RAS具有內(nèi)在的GTP酶活性，但其對GTP的高親和力和細胞內(nèi)GTP濃度的升高使得開發(fā)競爭性抑制藥物的可能性很小。
然而，盡管這些基因被稱為“不可成藥的基因”，但最近的研究進展使得潛在的治療策略得以開發(fā)，并在最近取得了突破性進展：2021年5月，美國食品和藥物管理局（FDA）加速批準RAS GTPase家族抑制劑索托拉西布（Sotorasib）用于治療KRAS G12C突變的轉(zhuǎn)移性非小細胞肺癌（NSCLC）成人患者（7）。
靶向KRAS的成功案例
1. Ras家族Ras。蛋白家族由三個同源基因編碼，即HRAS、KRAS和NRAS，代表了一些最早被描述的致癌基因。它們最初在60年代被發(fā)現(xiàn)是誘發(fā)大鼠肉瘤的病毒成分（因此被稱為RAS：大鼠肉瘤病毒），它們的發(fā)現(xiàn)改變了我們對癌癥生物學的認識（7、8、9）。Ras蛋白屬于G蛋白（鳥苷酸核苷酸結(jié)合蛋白）類。它們以GTP結(jié)合的活性形式和GDP結(jié)合的非活性形式交替發(fā)揮作用，就像多個信號通路的開關一樣（7）。所有三種形式的Ras都是膜相關蛋白，附著在細胞膜上對它們的功能至關重要。在靜止細胞中，Ras蛋白與GDP結(jié)合。受體酪氨酸激酶（RTKs）或GPCRs等各種膜受體可激活Ras信號傳導，這些受體與配體相互作用后，會將鳥嘌呤核苷酸交換因子（GEFs）招募到膜上，進而誘導GDP與Ras分離。在短暫的無核苷酸狀態(tài)之后，Ras與GTP結(jié)合，進入其活性狀態(tài)，在這種狀態(tài)下，它可以與各種效應蛋白相互作用，誘導不同的細胞反應。圖1描述了Ras下游的主要通路，如參與細胞周期進展的RAF/MAPK/ERK 通路；參與細胞存活和代謝調(diào)節(jié)的PI3K/AKT信號通路；參與細胞生長、分化和遷移的 PLCε/PIP2 級聯(lián)通路。在正常細胞中，Ras會被稱為GTP激活蛋白（GAP）的調(diào)節(jié)蛋白關閉，GAP會加速GTP的水解，使Ras轉(zhuǎn)變?yōu)闊o活性的GDP結(jié)合態(tài)。
圖1 Ras信號通路
RAS基因發(fā)生致癌突變后，最常見的后果之一就是對GAP產(chǎn)生抗性，從而持續(xù)處于活性狀態(tài)。約30%的人類癌癥中都存在RAS基因突變，其中KRAS基因突變最常見（約占80%），其次是NRAS（12%）和HRAS（3%）（5）。KRAS密碼子12和13都編碼甘氨酸殘基，是最常見的致癌激活位點，90%以上的記錄突變都發(fā)生在這些位點上。這些殘基與GDP/GTP結(jié)合袋相鄰。甘氨酸與其他氨基酸的替換會干擾GTP酶的活性，甚至在GAPs結(jié)合后也會將KRas鎖定在 GTP結(jié)合的活性狀態(tài)（11）。
2. 針對Ras的治療。鑒于RAS基因突變在人類癌癥中的發(fā)生率很高，多年來，人們一直在努力開發(fā)能夠?qū)筊AS基因突變的藥物。下面僅列舉幾個例子。有人嘗試抑制負責前炔化的酶，前炔化是Ras與細胞膜內(nèi)層結(jié)合所需的翻譯后修飾。目前有幾種藥物正在進行臨床試驗，其中一種名為Tipifarnib的藥物獲得了美國食品及藥物管理局（FDA）的“快速通道”認證，用于治療HRAS突變的頭頸部鱗狀細胞癌和T細胞淋巴瘤患者（5）。
另一種流行的策略是嘗試抑制下游信號傳導，即通過抑制通路的效應因子（如RAF/MEK/ERK或PI3K/Akt），或直接阻止Ras與這些效應因子的相互作用。到目前為止，第一種策略并沒有取得令人鼓舞的結(jié)果，這可能是由于細胞采用了代償機制。相反，Rigosertib作為一種Ras擬態(tài)化合物，似乎能夠阻斷Ras效應器的下游信號傳導，從而抑制臨床前模型中的腫瘤生長（5、12）。該分子目前正在進行多項臨床試驗。
最后，有關Ras突變體的結(jié)構(gòu)信息使我們能夠直接靶向Ras突變體。特別是 KRAS G12C（其中一個半胱氨酸殘基取代了由密碼子12編碼的甘氨酸）顯示了一個調(diào)節(jié)袋，人們利用這個調(diào)節(jié)袋開發(fā)出了對野生型RAS沒有檢測到影響的特異性抑制劑。其中，前面提到的Sotorasib（原名AMG510）是第一個獲得 FDA 批準的KRAS阻斷藥物。它能選擇性地、不可逆地抑制突變蛋白，并將其鎖定為無活性的GDP結(jié)合形式，從而使KRAS G12C腫瘤消退，并提高化療的抗腫瘤療效（13）。在臨床試驗“CodeBreak100”中，Sotorasib使36%的參與者的腫瘤縮�。ㄏ啾戎拢瑯藴石煼ǖ哪[瘤縮小率為20%）。這些腫瘤反應的中位持續(xù)時間為10個月（而標準療法的預期壽命較短）（14）。與其他任何藥物治療一樣，Sotorasib也會產(chǎn)生一些副作用，大多數(shù)情況下副作用較輕（如腹瀉、惡心、肌肉和骨骼疼痛），但有20%的參與者副作用較重。由于Sotorasib這么快就獲得了美國食品藥品管理局的加速批準，目前仍在進行更多的試驗，以確認該療法是否能幫助NSCLC患者延長壽命，而不會導致癌癥惡化（14）。希望這一成功故事不僅能在其他已在臨床試驗中的類似抑制劑中復制，而且還能促進針對不同KRAS突變的化合物的開發(fā)。
PROteolysis-TArgeting Chimaera（PROTAC）技術：挑戰(zhàn)“不可成藥”靶點
如上所述，盡管取得了令人鼓舞的重要科學進步，但藥物發(fā)現(xiàn)仍然在很大程度上依賴于使用能夠占據(jù)目標蛋白質(zhì)上特定活性位點、直接影響其功能的分子。因此，在缺乏這些確定區(qū)域的情況下，很難制定出適當?shù)牟呗浴?/span>
在這種情況下，最近開發(fā)出了多種雜多功能分子，它們將一種能結(jié)合感興趣的蛋白質(zhì)（POI）的配體與另一種能與E3泛素連接酶結(jié)合的配體綁在一起，促進前者的泛素化，然后由26S蛋白質(zhì)體降解，這可能會對“給“無法藥用”的基因下藥”產(chǎn)生重大影響。這些異功能分子被稱為PROteolysis-TArgeting Chimeras或PROTACs15（圖 2）。
圖2 PROTACs機制
PROTACs不需要基因修飾（不同于其他技術，如RNAi或基因KO）；不需要 POI上存在活性位點；使用濃度比傳統(tǒng)小分子低，因為與靶點的瞬時相互作用就足以將其導向蛋白酶體；它們還適用于通過過表達克服抑制劑作用的靶點，如癌癥中經(jīng)常出現(xiàn)的靶點（15、16）。例如，BRD4是一種轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳調(diào)控因子，通過激活多個癌基因（如c-Myc）的轉(zhuǎn)錄，在癌癥發(fā)展中發(fā)揮著關鍵作用。BRD4抑制劑會因BRD4表達增加而迅速失去藥效，而BRD4-PROTACs則不受這種機制的影響（16、17）。
Enzo life的PROTACs以表皮生長因子受體（EGFR）和BET溴域蛋白（如A1874）為靶標。這是一種基于堅果素的PROTAC，靶向BRD4，因此由BRD4配體（JQ1）與MDM2 E3配體（RG7388）連接組成。正如Hines J等人最近證明的那樣（15），A1874具有雙重功能，它能誘導其靶標降解，并伴隨著c-Myc的下調(diào)、P53的穩(wěn)定和P21的上調(diào)。
藥物發(fā)現(xiàn)的研究工具：
• SCREEN-WELL® Cancer Library和SCREEN-WELL® Kinase Inhibitor library等化合物庫可以成為癌癥抑制劑篩選和藥物開發(fā)的強大工具。
• AKT、PKA和PKC檢測試劑盒可以通過分析樣品中的致癌信號變異來補充篩選工作。
• CELLESTIAL®目錄中的熒光探針可對細胞內(nèi)反應（如細胞凋亡/壞死、細胞毒性、氧化應激、細胞器功能動態(tài)等）進行動態(tài)分析。
參考文獻：
1. Hopkins AL & Groom CR. The druggable genome. Nat Rev Drug Discov (2002). PMID: 12209152.
2. Ghadermarzi S, et al. Sequence-Derived Markers of Drug Targets and Potentially Druggable Human Proteins. Front Genet (2019). PMID: 31803227.
3. Zhao Z, et al. Targeting Strategies for Tissue-Specific Drug Delivery. Cell (2020). PMID: 32243788.
4. World Health Organization, Cancer - Key Facts.
5. Duffy MJ & Crown J. Drugging "undruggable" genes for cancer treatment: Are we making progress? Int J Cancer (2021). PMID: 32638380.
6. Rosas G, et al. ALK rearrangements: biology, detection and opportunities of therapy in non-small cell lung cancer. Crit Rev Oncol Hematol (2019). PMID: 30878128.
7. Nakajima EC, et al. FDA Approval Summary: Sotorasib for KRAS G12C-Mutated Metastatic NSCLC. Clin Cancer Res (2022). PMID: 34903582.
8. Gimple RC & Wang X. RAS: Striking at the Core of the Oncogenic Circuitry. Front Oncol (2019). PMID: 31681559.
9. Harvey JJ. An unidentified virus which causes the rapid production of tumors in mice. Nature (1964). PMID: 14243400.
10. Kirsten WH & Mayer LA. Morphologic responses to a murine erythroblastosis virus. J Natl Cancer Inst (1967). PMID: 18623947.
11. Naguib A, et al. Activation of K-RAS by co-mutation of codons 19 and 20 is transforming. J Mol Signal (2011). PMID: 21371307.
12. Atuluri-Divakar SK, et al. A small molecule RAS-mimetic disrupts RAS association with effector proteins to block signaling. Cell (2016). PMID: 27104980.
13. Canon J, et al. The clinical KRAS(G12C) inhibitor AMG 510 drives anti-tumor immunity. Nature (2019). PMID: 31666701.
14. NCI Staff. FDA Approval of KRAS Inhibitor Sotorasib for Lung Cancer Hailed as Milestone. Cancer.gov (2021).
15. Hines J, et al. MDM2-recruiting PROTAC Offers Superior, Synergistic Anti-proliferative Activity via Simultaneous Degradation of BRD4 and Stabilization of p53. Cancer Res (2019). PMID: 30385614.
16. Dang CV, et al. Drugging the 'undruggable' cancer targets. Nat Rev Cancer (2017). PMID: 28643779.
17. Lai AC & Crews CM. Induced protein degradation: an emerging drug discovery paradigm. Nat Rev Drug Discov (2017). PMID: 27885283.
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