細胞凍存與復(fù)蘇的主意事項及常見問題解答
慢凍快融！
慢凍快融！
慢凍快融！
凍存細胞時，細胞內(nèi)外環(huán)境中的水會形成冰晶。如果直接將細胞凍存到 -196℃ 的液氮中，由于凍結(jié)過程中胞外溶液中的水先結(jié)冰，使胞外溶液不斷濃縮，引起細胞電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水及蛋白質(zhì)變性等，會導(dǎo)致細胞受到機械性損傷。
在冷凍保存時，細胞外環(huán)境中的水會結(jié)冰。冷卻速度的不同會導(dǎo)致細胞由于滲透脫水而發(fā)生不同程度的收縮。細胞外環(huán)境的滲透壓隨著水結(jié)成冰晶而不斷升高，冷卻速度越慢，細胞內(nèi)水分通過滲透作用移出細胞的時間就越長。因此，非常緩慢的冷卻可能會導(dǎo)致細胞因過度脫水而死亡 (A)。而快速冷卻 (C) 會導(dǎo)致細胞內(nèi)形成冰晶，這會導(dǎo)致細胞在復(fù)溫時死亡。中間冷卻速度 (B) 則可以平衡滲透脫水和細胞內(nèi)結(jié)冰形成的風(fēng)險，通�？梢詫崿F(xiàn)細胞存活率最大化。
如果在凍存液中加入保護劑 (如 DMSO)，可使冰點降低，增加細胞滲透壓穩(wěn)定性。減緩慢速降溫過程中的脫水皺縮現(xiàn)象，在緩慢凍結(jié)時減少冰晶的生成，使細胞免受損傷[1]。
圖 1. 不同冷卻速度對細胞存活率的影響。
而在復(fù)蘇時，需要快速升溫，在 1-2 min 內(nèi)融化并稀釋，這時細胞內(nèi)外還來不及形成較大的冰晶，也不會使細胞長時間暴露在高濃度的電解質(zhì)溶液中，從而避免細胞損傷，提高細胞存活率。往期小 M 還為大家介紹了細胞凍存和復(fù)蘇的步驟 (詳見往期推文：產(chǎn)品上新丨MCE 無血清無蛋白細胞凍存液)。
了解了慢凍快融的原理，還有哪些 Tips 可以提高凍存和復(fù)蘇的成功率呢？一起來看看小 M 為大家準備的避坑指南吧！
“這次的細胞好像有點少，算了先凍起來吧！”
“哎？凍存液好像配少了，算了少放點吧！”
“哎呀！昨天細胞放在 -20℃ 忘記轉(zhuǎn)移了，現(xiàn)在再放到 -80℃ 應(yīng)該也沒事吧！”
……
停！
這是妥妥的挖坑行為！
那么凍存細胞的最佳時機是什么時候？什么樣的細胞濃度合適？要用多少凍存液呢？怎么實現(xiàn)細胞的“慢凍”呢？看小 M 為大家一一揭曉~
復(fù)蘇后第二天發(fā)現(xiàn)細胞沒有活？好不容易復(fù)蘇的細胞竟然污染了？怎么才能讓細胞滿血復(fù)活呢？繼續(xù)和小 M 一起往下看吧！
■ 細胞拿取
盡量減少樣品從液氮或 -80℃ 取出到放置在解凍裝置中之間被動升溫的時間，否則會大大影響細胞活力。如果儲存裝置和解凍裝置相隔較遠，可使用裝有干冰 (-80°C) 或液氮 (-196°C) 的隔熱容器臨時保存和運送細胞。(注意：從液氮中取細胞時要佩戴護目鏡和手套，謹防凍傷及凍存管爆炸！)
■ 解凍方式a) 解凍細胞時需要快速升溫 (50~100℃/min) 才能最大保存細胞活力，最優(yōu)的解凍方式是 37℃ 水浴[3]。從液氮或 -80℃ 取出凍存的細胞后，稍擰松管蓋，防止解凍過程中凍存管炸裂。放入 37℃ 水浴中，持續(xù)搖晃 1-2 分鐘直至解凍。
通常建議在可見冰融化但樣品仍然冰冷（~0℃）時立即停止解凍，常見的做法是在只剩下一小片冰時從水浴鍋中取出樣品。升溫至室溫或更高溫度會增加冷凍保護劑的細胞毒性，這會極大影響細胞活力[1]。
b) 不建議室溫解凍細胞，因為這會導(dǎo)致細胞死亡。
c) 為降低污染風(fēng)險，水浴解凍時凍存管管口要高于水面，避免水流入凍存管，水浴鍋中的無菌水也要定期更換。■ 稀釋
解凍后應(yīng)盡快稀釋，以減少 DMSO 的細胞毒性。按照培養(yǎng)基：凍存液 ≥10:1 的比例加入培養(yǎng)基進行稀釋，然后離心并更換培養(yǎng)基重懸細胞，這樣可以減少由滲透壓變化導(dǎo)致的細胞應(yīng)激。■ 換液
依據(jù)細胞狀態(tài)，在細胞貼壁后或 24 h 后換液，繼續(xù)培養(yǎng)。
Q：為什么我復(fù)蘇的細胞完全不貼壁？
A：可能是由于細胞凍存前生長狀態(tài)差或者復(fù)蘇過程中動作慢，因此一定要挑選生長狀態(tài)良好、處于對數(shù)生長期的細胞進行凍存，操作過程要遵循“慢凍快融”的原則！
Q：為什么我復(fù)蘇細胞的時候明明已經(jīng)貼壁了，第二天再去看發(fā)現(xiàn)細胞全死了？
A：可能是細胞凍存之前消化過度，導(dǎo)致細胞凋亡，因此消化細胞時一定要嚴格控制消化時間哦！
Q：細胞復(fù)蘇后只有非常少量細胞貼壁，是不是需要重新復(fù)蘇？
A：先不要著急丟掉！可以補加血清和細胞因子，或者每隔 2-3 天換新鮮的生長培養(yǎng)基，經(jīng)過 2-3 次換液后，大部分細胞就能看到明顯增殖，此時再按照正常傳代操作即可。當(dāng)然，如果細胞庫存充足，或者著急做實驗，可以重新復(fù)蘇一株細胞~
Q：凍存液配多了，不想浪費，可以留到下次用嗎？
A：配好的凍存液在 4℃ 可以暫存 1 周，在 -20℃ 最多可保存一個月。不過最好還是現(xiàn)配現(xiàn)用、避免反復(fù)凍融。
本期小 M 為大家介紹了細胞凍存與復(fù)蘇的相關(guān)注意事項，看完小 M 分享的避坑指南，是不是對細胞凍存和復(fù)蘇的原理以及操作要點了然于心了呢？帶著這份指南，一起養(yǎng)出活力滿滿的細胞吧！
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Penicillin-Streptomycin (100×), Sterile 是已過濾除菌，可直接用于細胞培養(yǎng)的雙抗溶液 MCE 特級胎牛血清 (Fetal Bovine Serum) 來源于非疫區(qū)健康牛 (不含 BVDV、PI3、IBR、BTV 等牛源病毒)，由剖腹產(chǎn) 5-8 月齡胎牛的血液制備而成。 |
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DMEM (High Glucose, L-Glutamine, Pyruvate, Phenol Red, no HEPES), DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) 是廣泛使用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，適于培養(yǎng)多種哺乳動物細胞，包括 Hela、293、Cos-7、PC-12 等細胞系，以及原代成纖維細胞、神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、人臍帶靜脈內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞等。 |
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MCE 無血清無蛋白細胞凍存液是一種非程序性即用型細胞凍存液。該產(chǎn)品既適用于常規(guī)哺乳動物細胞的凍存，也適用于無血清培養(yǎng)細胞的凍存。 |
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MCE BM-Cyclin 主要成分為延胡索酸泰妙菌素（Tiamulin fumarate）和鹽酸米諾環(huán)素（Minocycline hydrochloride），可在不影響細胞狀態(tài)的前提下，有效抑制和清除在細胞培養(yǎng)中廣泛存在的支原體污染，對于常見的革蘭氏陰性和陽性菌也有一定的清除作用。 |
| 青霉/鏈霉素雙抗溶液
Penicillin-Streptomycin (100×), Sterile 是已過濾除菌，可直接用于細胞培養(yǎng)的雙抗溶液。 |
[1] Baust JM, et al. Best practices for cryopreserving, thawing, recovering, and assessing cells. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2017;53(10):855-871.
[2] Loecker W, et al. Effects of cell concentration on viability and metabolic activity during cryopreservation. Cryobiology. 1998;37(2):103-109.
[3] Baust,et al. Development and Assessment of a Novel Device for the Controlled, Dry Thawing of Cryopreserved Cell Products. BioProcessing Journal. 2016;15. 30-41.
