Moxi Go II助力哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)中細(xì)胞質(zhì)量密度的均勻性和穩(wěn)定性研究

如何破解細(xì)胞大小之謎，一直是生命科學(xué)領(lǐng)域的熱門話題。很早就清楚細(xì)胞大小源于細(xì)胞生長和分裂的頻率平衡，決定了細(xì)胞內(nèi)的幾何結(jié)構(gòu)和細(xì)胞器大小，并影響細(xì)胞產(chǎn)生蛋白質(zhì)和其他分子的方式，進(jìn)而影響生物合成過程。同時細(xì)胞大小結(jié)合細(xì)胞周期的變化，反映了生物體新陳代謝和對環(huán)境的生理適應(yīng)的變化。最近，諸多研究者聚焦于細(xì)胞大小中細(xì)胞質(zhì)量或細(xì)胞體積的控制機(jī)制研究。細(xì)胞體積可通過庫爾特原理或3D顯微鏡進(jìn)行測量，單個細(xì)胞的質(zhì)量定量則是直接記錄浮力或干質(zhì)量（主要由生物合成和降解的總和決定）。如果細(xì)胞體積在生長過程中與細(xì)胞干質(zhì)量成比例，則細(xì)胞質(zhì)量密度保持恒定，可以用細(xì)胞干質(zhì)量除以細(xì)胞體積來計算。然而細(xì)胞的生命活動紛繁復(fù)雜，例如生長、分化或衰老，以及細(xì)胞類型不同，導(dǎo)致細(xì)胞大小和體積的變化，從而引起細(xì)胞干質(zhì)量和細(xì)胞體積的比例關(guān)系隨之改變。因此如何較為穩(wěn)定的實現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)量密度的測量受到了研究者的關(guān)注。

 

最理想的方式是直接、準(zhǔn)確地測量細(xì)胞的質(zhì)量密度，但是現(xiàn)有的幾種方式皆有局限性，誤差較大。為此，來自哈佛醫(yī)學(xué)院的Xili Liu等人開發(fā)了歸一化拉曼成像-Normalized Raman Imaging （NoRI）。NoRI能夠?qū)�活�?xì)胞或光學(xué)切片固定細(xì)胞中的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和水密度進(jìn)行無標(biāo)記的直接測量；總質(zhì)量通過細(xì)胞體積上的質(zhì)量密度積分，基于z堆疊圖像計算，靈敏度可達(dá)15 mg/ml。相關(guān)研究以“The uniformity and stability of cellular mass density in mammalian cell culture“為題，發(fā)表在《Frontiers in Cell and Developmental Biology》上。
 

本研究采用三種不同類型的哺乳動物細(xì)胞系，HeLa (CCL-2人癌癥細(xì)胞系），NIH3T3 (CRL-1658，狗上皮細(xì)胞系）和RPE-1 (CRL- 4000)，小鼠纖維細(xì)胞系），使用NoRI顯微鏡直接測量細(xì)胞中蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的質(zhì)量密度，研究質(zhì)量密度如何對細(xì)胞外的滲透應(yīng)激、蛋白質(zhì)合成的抑制、蛋白質(zhì)降解的抑制、細(xì)胞骨架破壞和其他生理狀態(tài)變化等各種擾動做出反應(yīng)。作者將上述三種細(xì)胞分別在饑餓培養(yǎng)基（無血清，滲透壓350mOsm）、+200mOsm高滲培養(yǎng)基（總滲透壓542 mOsm）、+400mOsm高滲培養(yǎng)基（總滲透壓742 mOsm）、低滲培養(yǎng)基（滲透壓158mOsm）以及雷帕霉素、環(huán)己酰胺、諾可唑和Ouabain八水合物等藥物中進(jìn)行處理，處理完成后對細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成速率、細(xì)胞增殖、SAβ-半乳糖苷酶活性和免疫熒光多項指標(biāo)進(jìn)行檢測。SE蛋白染色法（固定細(xì)胞染色后通過熒光顯微鏡成像）估算細(xì)胞的干質(zhì)量，Coulter原理測量細(xì)胞體積，NoRI顯微鏡測量細(xì)胞中蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的質(zhì)量密度以及細(xì)胞周期。檢測相關(guān)圖像及數(shù)據(jù)均由Matlab（Mathworks）或Image J（National Institute of Health）的自定義設(shè)置和分析。

 

文章中對于細(xì)胞體積的測量，采用了Orflo Technologies公司提供的Moxi Go II，庫爾特原理的快速流式細(xì)胞儀，具體操作：0.05%或0.25%胰蛋白酶-EDTA胰蛋白酶消化細(xì)胞， 重懸于相應(yīng)的藥物或滲透壓DMEM中，然后選擇預(yù)設(shè)程序“細(xì)胞計數(shù)（僅限大�。�”完成細(xì)胞體積的測量。在Moxi GOⅡ測量結(jié)果中，細(xì)胞樣本中的碎片或死細(xì)胞可通過設(shè)置細(xì)胞的直徑門控而排除掉。

部分結(jié)果如下：

 

圖1. 在MDCK和HeLa細(xì)胞中，細(xì)胞大小隨滲透擾動而變化：A，C，在MDCK（A）和HeLa（C）細(xì)胞中，通過SE蛋白染色估算的干質(zhì)量變化。B，D，在MDCK（B）或HeLa（D）細(xì)胞中，通過庫爾特原理測量的細(xì)胞體積變化。在低或+200mOsm高滲培養(yǎng)基中處理1小時或在3μM ouabain中處理5小時后測量細(xì)胞。N=8524-16257個細(xì)胞（干質(zhì)量），N=3145-8000個細(xì)胞（體積）。（A-D）中的紅色虛線表示對照樣品的中位數(shù)。

 

圖2. 細(xì)胞骨架擾動增加了HeLa和MDCK細(xì)胞中的蛋白質(zhì)密度。細(xì)胞在5μM 細(xì)胞松弛素D（+CytoD）或5μM諾可唑（+Noco）中處理1小時。A，I，通過SE熒光估算細(xì)胞干質(zhì)量。B，J，通過庫爾特原理測量的細(xì)胞體積。C，K，通過OPP脈沖標(biāo)記與SE蛋白質(zhì)染色比率（OPP/SE）定量蛋白質(zhì)合成速率。

研究者通過比較細(xì)胞體積、細(xì)胞干質(zhì)量和細(xì)胞質(zhì)量密度的變化系數(shù)發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)和脂質(zhì)密度在不同類型的細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)都高度一致。雖然細(xì)胞質(zhì)量密度在細(xì)胞周期中變化不大，但是和YAP（ Hippo通路中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄輔因子）定位之間存在功能聯(lián)系，又會因外部滲透脅迫、細(xì)胞骨架破壞以及細(xì)胞的衰老和饑餓等發(fā)生改變。這些差異反應(yīng)可以幫助我們了解生理和病理條件下細(xì)胞大小和質(zhì)量密度調(diào)節(jié)的本質(zhì)。

Moxi GO II
 

Moxi GO II采用庫爾特原理進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)和粒徑測量，同時采用488nm激光光源，結(jié)合兩個PMT通道，525/45nm通道和561nm/LP（或者646nm/LP，可根據(jù)需要更換），進(jìn)行細(xì)胞活率、細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)染效率、活性氧簇、線粒體膜電位等常規(guī)流式檢測。儀器設(shè)計小巧輕便，無需預(yù)熱，開機(jī)即用，預(yù)設(shè)程序，觸屏操控，運行后10秒即可給出測試結(jié)果，使用后也無需清潔維護(hù)。無論是經(jīng)驗豐富的流式專家，還是初試身手的實驗小白，Moxi Go II都可以助您輕松完成實驗。

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https://doi.org/10.3389/fcell.2022.1017499

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