免疫細胞培養(yǎng)通關技巧之分型鑒定的基本流程

免疫細胞培養(yǎng)的六個基本流程：樣本制備、細胞分選、分型鑒定、擴增&培養(yǎng)、質(zhì)量優(yōu)化、后續(xù)研究。小優(yōu)已經(jīng)給大家詳細介紹了《免疫細胞培養(yǎng)通關技巧之樣本制備》和《免疫細胞培養(yǎng)通關技巧之細胞分選》，今天我們繼續(xù)一起學習分型鑒定的相關內(nèi)容。

分型鑒定（Phenotyping）：利用細胞表面標記物進行細胞鑒定，目前常用的方法是流式細胞術。

 

寫在前面：

如果我們利用流式分選得到目的細胞，一般來說，分選后需要回測細胞進行目的細胞的純度驗證，即分型鑒定，也就是說流式分選后目的細胞的分型鑒定與分選所用的細胞標記物基本相同。

如果我們利用磁珠分選得到目的細胞，就意味著我們需要再設計一個流式實驗進行分型鑒定。

下面，小優(yōu)給大家介紹通過流式細胞術進行免疫細胞分型鑒定需要確定的【六大方面】：

 

01 細胞數(shù)量

分選后的細胞懸液需要進行計數(shù)，一般為5~10*106/ml，確保有足夠的細胞數(shù)量可以上機。

02 細胞表面標記物

細胞表面標記物的重要性不言而喻，細胞分選時也會涉及到，分型鑒定時我們也需要通過細胞表面標記物來進行圈門邏輯的設置。需要注意的是，分型鑒定后的細胞需要進行體外擴增培養(yǎng)，不能選擇細胞的胞內(nèi)標記物（胞內(nèi)檢測需對細胞進行固定破膜處理，最后得到的就是死細胞了）。
 

比如磁珠分選小鼠脾臟Treg細胞后進行流式分型鑒定的圈門邏輯如下：

 

圖1 流式鑒定小鼠脾臟Treg細胞圈門邏輯

 

03 熒光素標記

流式分選和流式鑒定的配色原則是一致的，抗體偶聯(lián)熒光素的選擇原則，小優(yōu)在【細胞分選】中已經(jīng)給大家匯總啦，小伙伴們按需查看。

 

04 死活染料

如果分選后的細胞立即進行分型鑒定，一般不用染死活，凍存細胞建議加入死活染料染色。

目前流式用死活染料分為兩大類：胺基類染料、核酸類染料。兩者的原理、使用階段、對應的特定通道小優(yōu)也給大家做了匯總。由于核酸類死活染料可選產(chǎn)品少，占據(jù)了一些重要的熒光通道，小優(yōu)也建議大家優(yōu)先抗體配色后進行核酸類死活染料的熒光搭配選擇。

 

圖2死活染料原理及對應的特定通道

 

Tips：

①使用FVS等胺基類染料時，需要使用無疊氮鈉和無蛋白的DPBS溶液進行洗滌和重懸細胞；

②染完FVS之后，需要使用含有蛋白（FBS、BSA）的染色液洗滌兩次，使游離的FVS染料失效，便于后續(xù)染色；

③核酸類染料的加入為所有操作的最后一步，臨上機前5-10 min加入即可，無需洗滌；

④核酸類染料與核酸空間共價結(jié)合，熒光弱，染色后，避免洗滌，劇烈渦旋或過度用力吹打，避免核酸類死活染料的脫落，導致假陰性；

⑤核酸類死活染料染色后，需及時上機（1h內(nèi)），避免染料的毒副作用導致額外的死細胞產(chǎn)生；

⑥核酸類死活染料4℃保存，不能凍存。

 

05 流式對照

流式對照對于實驗的成功也是至關重要的，小優(yōu)在下表里也給大家列舉了一些對照的作用以及它們的應用場景。

 

圖3 流式對照匯總

 

Tips：

Fc受體阻斷劑推薦使用，可減少抗原抗體的非特異性結(jié)合以及產(chǎn)生過強的背景信號，可使用：

①商業(yè)化Fc Block

②樣本種屬或流抗來源種屬的血清

③樣本種屬或流抗來源種屬的IgG

 

06 染色方案

染色方案也可通過預實驗來確定，主要是為了防止熒光選擇不當，導致染色信號過強或過弱。需要考慮的因素包括但不限于抗體用量、染色體積、孵育時間、孵育溫度、洗滌次數(shù)等。

 

Tips：

①不同的檢測指標、抗體品牌、熒光素標記、抗體批次都會導致抗體的效價不同，要得到最優(yōu)的實驗方案和結(jié)果，我們要對每一個抗體進行抗體滴定實驗以確定最佳的抗體用量；

②一般來說，染色體積不變，抗體用量不變（細胞數(shù)量10倍左右的浮動范圍穩(wěn)定）；染色體積增加，必須增加抗體用量以保持抗體濃度穩(wěn)定；

③染色體積一般為50-100μl；

④抗體孵育時間與溫度：最常用的是4℃，30-60 min，可減少非特異性結(jié)合，熒光最穩(wěn)定不易淬滅；臨床檢測最常用室溫（20℃左右），15-30 min；

⑤細胞離心，推薦300g-500g，5 min，抗體的洗滌推薦直接使用流式管操作，1次洗液用量2ml；

⑥為了保證細胞的活力，染色后需盡快上機。

小優(yōu)也給大家針對上述內(nèi)容做了重點匯總：

圖4 利用流式進行免疫細胞分型鑒定重點總結(jié)

 

寫在最后：

如果磁珠分選后的細胞我們不能立即進行分型鑒定，那就涉及到細胞的保存以及活力測定。

短期保存：將分選得到的細胞用適量含10%-20%滅活小牛血清的Hanks、Tc-199、RPMI1640或其他培養(yǎng)基重懸至合適密度，置于4℃保存。

長期保存：液氮深低溫（-196℃）保存細胞，可加入10%二甲亞砜（DMSO）作為保護劑。

活力測定：最簡便常用的方法為臺盼藍染色法。臺盼藍是一種陰離子型染料。這種染料不能透過活細胞正常完整的細胞膜，故活細胞不著色；死細胞的細胞膜通透性增加，染料可通過細胞膜進入細胞，故死細胞著色呈藍色。

做好細胞的保存、復蘇及復蘇后的活力測定，就可以按照上面的步驟再通過流式細胞術進行細胞的分型鑒定了！
 

好啦，免疫細胞培養(yǎng)通關技巧之分型鑒定的內(nèi)容也給大家介紹完了，下一個擴增&培養(yǎng)，我們不見不散呀！

 

資料來源：

圖片來源于優(yōu)寧維；視頻來源于嗶哩嗶哩半瓶流式小美膩