三種鐵死亡新抑制機制及DHODH抑制劑在癌癥研究中的應用

眾所周知，谷胱甘肽過氧化物酶 4 (GPX4) 和鐵死亡抑制蛋白 1 (FSP1) 構成了鐵死亡的兩大主要防御系統(tǒng)→

1) GPX4 通過減少谷胱甘肽 (GSH) 來減少脂質氫過氧化物造成的毒性；

2) FSP1 是不依賴谷胱甘肽的鐵死亡抑制因子，它作為氧化還原酶，在細胞膜上將輔酶 Q (CoQ) 還原為泛醇 (CoQH₂)，CoQH₂ 作為一種捕獲自由基的親脂性抗氧化劑，可以抑制脂質過氧化物。
 

但近期美國 MD 安德森癌癥中心甘波誼教授團隊在 Nature 上發(fā)表的文章 “DHODH-mediated ferroptosis defence is a targetable vulnerability in cancer” 揭示了第三種鐵死亡抑制機制。這項研究證實了線粒體二氫乳清酸脫氫酶 (DHODH) 介導的鐵死亡防御機制，并且提出了通過抑制 DHODH 治療癌癥的新策略。

 

圖 1. GPX4、FSP1 和 DHODH 的鐵死亡抑制機制^[1]

 

■ DHODH 參與鐵死亡的調節(jié)

作者團隊通過代謝組學分析發(fā)現(xiàn)，在癌細胞中用 GPX4 抑制劑 RSL3 或 ML162 處理會導致 N-氨基甲酰-L-天冬氨酸 (C-Asp，嘧啶生物合成的中間體) 顯著消耗，并伴隨尿苷 (Uridine; 嘧啶生物合成的最終產物) 的積累，然而鐵死亡抑制劑 (Liproxstatin-1) 能夠降低 RSL3 處理后增加的 ¹⁵N-UMP(尿苷-¹⁵N₂ 5'-單磷酸) 的水平 (圖 2a-b)。
另外，通過用 C-Asp 補充細胞實驗表明二氫乳清酸 (DHO，DHODH 的底物) 抵抗 GPX4 的抑制作用，而乳清酸 (OA，DHODH 的產物) 增強細胞對 GPX4 抑制劑的敏感性。然而，補充尿苷并不影響細胞對 GPX4 抑制劑的敏感性 (圖 2c)。綜上，作者團隊發(fā)現(xiàn) DHODH 參與了細胞鐵死亡的調節(jié)，而且底物 DHO 和產物 OA 對鐵死亡的敏感性相反，說明 DHODH 可能以獨立于嘧啶核苷酸合成功能的方式調節(jié)鐵死亡。

 

圖 2. a: 嘧啶生物合成途徑的簡化示意圖; b: RSL3 和/或 Liproxstatin-1 (Lip-1) 處理的 HT-1080 細胞中的 ¹⁵N-UMP 水平; c: 對照、C-Asp、DHO、OA、uridine 預處理后，RSL3 處理 NCI-H226 細胞的活力^[1]

 

作者團隊對一組 GPX4^high 和 GPX4^low 癌細胞系的實驗分析表明， GPX4^low 癌細胞通常對 DHODH 抑制劑 Brequinar (BQR) 更敏感 (圖 3a-b)。另外，Liproxstatin-1 在很大程度上挽救了 GPX4^low NCI-H226 細胞中抑制 DHODH 誘導的細胞死亡，而用 BQR 未明顯誘導 GPX4^high HT-1080 細胞鐵死亡。同時，抑制 DHODH 在 GPX4^low 癌細胞中可以誘導強效脂質過氧化 (圖 3c-d) 和鐵死亡標記基因 PTGS2 的表達，而在 GPX4^high 癌細胞中則沒有，這可能是 GPX4^low 癌細胞對 DHODH 抑制劑敏感的原因。
此外，抑制 DHODH 可增強細胞對 class 2 鐵死亡誘導劑 (RSL3 和 ML162；抑制 GPX4 活性) 和 class 1 鐵死亡誘導劑 (Sulfasalazine 和 Erastin；阻斷 SLC7A11 介導的胱氨酸轉運) 的敏感性。綜上，抑制 DHODH 會誘導 GPX4^low 癌細胞中的鐵死亡，也會使 GPX4^high 癌細胞對鐵死亡敏感。
 

圖 3. a: 不同癌細胞系中的 GPX4、DHODH 和 FSP1 蛋白水平; b: 不同劑量的 BQR 對 GPX4^high 和 GPX4^low 細胞活力的影響; c-d: 對照、Z-VAD-FMK (ZVF) 和/或 Lip-1 預處理后，BQR 處‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍理的 NCI-H226/HT-1080 細胞中的脂質過氧化情況^[1]

 

■ DHODH 的缺失促進鐵死亡
先前的研究表明，DHODH 的表達與對 GPX4 抑制劑的抗性相關。作者團隊通過在 GPX4^high HT-1080 細胞和 GPX4^low NCI-H226 細胞中敲除 DHODH 發(fā)現(xiàn)，DHODH 的缺失使 HT-1080 細胞對 RSL3 或 ML162 誘導的脂質過氧化和鐵死亡顯著敏感；在 NCI-H226 細胞中，DHODH 缺失即使在補充尿苷的情況下也能強烈誘導脂質過氧化和鐵死亡。此外，HT-1080 細胞中 GPX4 的部分敲低也會使細胞對抑制 DHODH 而誘導的脂質過氧化和鐵死亡顯著敏感 (圖 4a-d)。
此外，GPX4 敲低的細胞中 DHODH 的缺失顯著誘導脂質過氧化和鐵死亡。在 DHODH 敲除細胞中補充尿苷可以挽救細胞死亡，但在 GPX4 敲除的細胞中不能，因此，DHODH 與 GPX4 是平行作用來抑制鐵死亡的。作者團隊實驗并進一步證明了 DHODH 是與線粒體 GPX4 平行作用的，而不是細胞溶質 GPX4 或 FSP1。綜上，DHODH 缺失誘導 GPX4^low 癌細胞 (或 GPX4 敲低的 GPX4^high 癌細胞) 中的鐵死亡。
 

圖 4. a: 用 RSL3 處理的 Cas9 對照和 DHODH KO (2/4) HT-1080 的細胞活力; b: Cas9 對照和 RSL3 處理的 DHODH KO HT-1080 細胞中的脂質過氧化; c: Cas9 對照和 DHODH KO NCI-H226 細胞中的脂質過氧化; d: 對照、尿苷或尿苷+ Lip-1 處理的 Cas9 對照和 DHODH KO NCI-H226 細胞的存活^[1]
 
■ DHODH 抑制線粒體鐵死亡

作者的團隊發(fā)現(xiàn) DHODH 與線粒體 GPX4 平行作用來抑制線粒體脂質過氧化和鐵死亡后，進一步證明了 DHODH 以 CoQ 依賴性方式抑制線粒體脂質過氧化和鐵死亡，即 DHODH 通過將線粒體中的 CoQ 還原為 CoQH₂ 來抑制鐵死亡。

 
■ DHODH 與腫瘤鐵死亡
接下來，作者團隊在小鼠體內進一步研究了 DHODH 抑制劑的治療潛力。在小鼠模型中，單獨使用DHODH 抑制劑 BQR 處理或 GPX4 敲低不會影響小鼠體內 HT-1080 異種移植瘤的生長，但 GPX4 敲低會使 HT-1080 異種移植瘤對 DHODH 的抑制敏感。而 Liproxstatin-1 在很大程度上恢復了用 BQR 治療的 GPX4 敲低的腫瘤的生長 (圖 5a-b)。
同樣，BQR 抑制 GPX4^low NCI-H226 異種移植瘤或 GPX4^low 腫瘤患者來源的異種移植瘤 (PDX) 生長，但不抑制 GPX4^high PDX 生長，并且可以通過 Liproxstatin-1 治療恢復抑制的腫瘤生長 (圖 5c)。
最后，作者團隊聯(lián)合 BQR 和 Sulfasalazine 協(xié)同誘導脂質過氧化并抑制 HT-1080 異種移植瘤生長，并通過 Liproxstatin-1 治療同樣可以在很大程度上恢復抑制的腫瘤生長。
綜上表明 DHODH 抑制劑具有治療 GPX4^low 癌癥的潛力，并且 DHODH 抑制劑與 Sulfasalazine 的組合具有治療 GPX4^high 癌癥的潛力。
 

圖 5. a: shControl HT-1080、b: shGPX4 HT-1080、c: NCI-H226 異種移植的腫瘤體積^[1]

 

總結：
作者團隊發(fā)現(xiàn)至少存在三種鐵死亡抑制機制，他們在亞細胞結構上都有獨特的地位：胞質和線粒體中的 GPX4、質膜上的 FSP1 和線粒體中的 DHODH。

DHODH 和線粒體 GPX4 構成了兩個主要的防御性武器，消除線粒體中的脂質過氧化物，其中一條路走不通了，都會迫使細胞更依賴于另一條路，當兩條路都堵死了，就會觸發(fā)主要由線粒體脂質過氧化導致的鐵死亡。重要的是，這篇文章提出，通過 DHODH 抑制劑靶向鐵死亡是潛在的癌癥治療方法。

 

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DHODH 抑制劑

Brequinar 有效的 DHODH 抑制劑，對人的 DHODH IC50 值為 5.2 nM，也是一種廣譜的抗病毒劑。

Leflunomide DHODH 抑制劑；一種嘧啶合成抑制劑；具有抗風濕的作用。

Teriflunomide DHODH 抑制劑；抑制嘧啶合成，有效降低 T 細胞和 B 細胞增殖。

Ferroptosis 誘導劑

RSL3 Ferroptosis 誘導劑；是一種 GPX4 的抑制劑，可降低 GPX4 的表達，誘導頭頸部癌細胞的肥大性死亡。

Sorafenib Ferroptosis 激活劑；有效的 Raf 抑制劑；誘導細胞自噬 (autophagy) 和凋亡 (apoptosis)，并具有抗腫瘤活性。

Cisplatin Ferroptosis 激活劑；誘導自噬 (autophagy)；是一種抗腫瘤的化療劑。

Erastin Ferroptosis 誘導劑；可以結合且抑制電壓依賴性陰離子通道 (VDAC2/VDAC3)。

Ferroptosis 抑制劑

Ferrostatin-1 選擇性的 Ferroptosis 抑制劑；是一種人工合成的抗氧化劑，通過還原機制來防止膜脂的損傷，從而抑制細胞死亡；具有抗真菌活性。

SP600125 Ferroptosis 抑制劑；口服有效的，可逆的，ATP競爭性的 JNK 抑制劑；抑制自噬 (autophagy)，誘導凋亡 (apoptosis)。

Liproxstatin-1 一種有效的 ferroptosis 抑制劑，抑制 ferroptotic 細胞死亡 (IC50=22 nM)。

化合物庫

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縮寫

DHO: Dihydroorotate

OA: Orotate
GPX4: Glutathione peroxidase 4
FSP1: Ferroptosis suppressor protein 1

 

參考文獻
 

1. Chao Mao, Boyi Gan, et al. DHODH-mediated ferroptosis defence is a targetable vulnerability in cancer. Nature. 2021 May 12.