實驗方案：微滴/微球制備儀制備殼聚糖微球
實驗目的：
本實驗方案通過利用微滴/微球制備儀，以Drop-Surf微滴生成油為油相，以5%殼聚糖為水相制備高單分散的微滴，并與接收液油相中的戊二醛發(fā)生Schiff堿反應實現微滴的固化。最終獲得具有極高的單分散性的殼聚糖微球(CV<5%)。
引言：
殼聚糖是一種功能線性聚合物，是由甲殼素部分去乙�；�[1-3]。因其來源廣泛、無毒、價格低廉、良好的生物相容性和可降解而備受關注。近年來，殼聚糖作為一種新型功能材料，以纖維、膜、微球和膠囊等形式在蛋白吸附分離、催化劑載體、酶的固定化、重金屬吸附和藥物釋放等方面具有很大的應用潛力[2]。此外，殼聚糖在每個C6原子單元上都有一個游離的氨基，這使得殼聚糖可以與醛基發(fā)生Schiff堿反應，且在這一反應過程中生成的C=N鍵發(fā)生n-π*躍遷產生自發(fā)熒光[2]。而這種熒光恰恰可以應用于血液循環(huán)追蹤、細胞外基質表征、體內細胞成像等領域。因此，殼聚糖在生物、醫(yī)藥、化學和環(huán)境等領域都有良好的應用前景。
殼聚糖微球粒徑的均一度控制對其在生物、醫(yī)藥和催化等領域的成功應用至關重要。目前制備殼聚糖微球的方法有乳化固化、簡單凝聚、復合凝聚和膜乳化等[2,4]。雖然這些技術完全可行，但也存在著很大的缺點，如產率不穩(wěn)定、程序復雜、粒徑分布不均和重復性差等。因此，開發(fā)一種可重復、粒徑及均勻度可控的殼聚糖微球制備技術是其成功應用的必要條件。FluidicLab微滴制備平臺運用液滴微流控技術，通過微滴/微球制備儀制備高度均一的殼聚糖微滴，再與戊二醛發(fā)生Schiff堿反應實現微滴的固化，最終得到殼聚糖微球。該法操作簡便，樣品利用率高，制備得到的微球單分散性高(CV<5%)，具有較好重復性。
實驗材料：
實驗步驟：
2. 微滴制備：
微滴/微球制備儀的安裝連接
微滴/微球制備儀安裝連接參考《微滴/微球制備儀使用手冊V.1.0》中“2. 微滴/微球制備儀的安裝連接”的部分；其連接如下(步驟③-⑦連接效果如下圖所示)：
① 用氣管依次連接“空氣壓縮機”--“氣源處理裝置”--“微滴/微球制備儀”；
② 將微滴/微球制備儀分別與電源、電腦的連接；
③ 用氣管分別將A0(壓力輸出通道一)和A1(油相15 mL儲液池)，B0(壓力輸出通道二)和B1(水相1.5 mL儲液池)連接；
④ 用配有1/4-28螺紋接頭和卡箍的PEEK管(內/外徑 0.25 mm/1.6 mm)分別將A1(油相15 mL儲液池)和A2(通道一流量傳感器)，B1(水相1.5 mL儲液池)和B2(通道二流量傳感器)連接；
⑤ 用配有1/4-28螺紋接頭和卡箍的PEEK管(內/外徑 0.25 mm/1.6 mm)分別將A2(通道一流量傳感器)和A3(PDMS芯片的油相入口)，B2(通道二流量傳感器)和B3(PDMS芯片的水相入口)連接；
⑥ C為標準PDMS芯片和夾具的組合，芯片和夾具的入口通過硅膠塞密封；
⑦ 用PEEK管(內/外徑 0.25 mm/1.6 mm)將芯片出口D處生成的乳液導出。
2. FluidicLabSuite軟件的安裝和設備的添加：
FluidicLabSuite軟件的安裝參考《微滴/微球制備儀使用手冊V.1.0》中“3.1 FluidicLabSuite軟件的安裝”的部分；
3. 殼聚糖微液滴的制備：
具體操作步驟如下(參考視頻“微流控應用：微滴生成儀制備殼聚糖微球”)：
① 分別在15 mL油相儲液池(通道一)和1.5 mL水相儲液池(通道二)中依次加入5 mL微滴生成油和1 mL 5%的殼聚糖水溶液；
② FluidicLabSuite軟件的設備添加參考《微滴/微球制備儀使用手冊V.1.0》中“3.2 FluidicLabSuite軟件的設備添加”的部分(相機和流量傳感器僅需添加一次)；
③ 打開空氣壓縮機和氣源處理裝置開關；
④ 在乳液出口端放置離心管接收微滴穩(wěn)定前的廢液；
⑤ 在電腦端設置通道一壓力(油相，如150 mbar)和通道二壓力(水相，如900 mbar，水相黏度大，流阻大，壓力更大)排出管路和芯片中的空氣；
⑥ 待管路和芯片中完全填充液體后(空氣被完全排出)；將整個系統(tǒng)由壓力控制切換到流速控制，并設置通道一(油相)和通道二(水相)流速分別為20和5 μL/min；
⑦ 調整反饋值(Feedback)快速達到設定流速，并實現流速的穩(wěn)定輸出；
⑧ 用疏水培養(yǎng)皿接收一滴乳液，并在普通光學顯微鏡下觀察其微滴的均勻性；
⑨ 待微滴生成均勻后，即可開始接收至裝有1%戊二醛油相溶液的1.5 mL離心管中；
⑩ 20 min后停止收集，密封于離心管中，輕微振蕩加快微滴固化，隨后靜置一段時間。
3. 殼聚糖微球的破乳清洗：
具體操作步驟如下(參考視頻“微流控應用：微滴生成儀制備殼聚糖微球”)：
① 取出1.5 mL離心管底部微滴生成油；
② 按V球：V破=1:2 加入破乳劑，振蕩破乳；
③ 2500 rpm離心處理1 min，并取出底部破乳劑；
④ 重復上述②和③操作；
⑤ 最終得到固化后的殼聚糖微球。
4. 微滴/微球制備儀清洗：
微滴生成儀每次使用完必須清洗管路、流量傳感器和芯片。
具體操作詳見“微滴/微球制備儀操作指導卡”。
結果與討論：
剛接收的微滴平均粒徑為107.53 μm，具有極高的單分散性(變異系數:CV=2.14%)。其顯微鏡圖和粒徑分布如下圖所示：
通過與戊二醛發(fā)生Schiff堿反應實現微滴的固化，最終獲得的殼聚糖微球平均粒徑為101.67 μm，具有極高的單分散性(變異系數:CV=2.53%)。其顯微鏡圖和粒徑分布如下圖所示：
參考文獻：
[1] Zhao H., et al. A novel microfluidic approach for monodispersed chitosan microspheres with enhanced autofluorescence, Chem. Eng. J., 215–216, 784-790 (2013).
[2] Xu, J.H., et al. A Novel Microfluidic Approach for Monodispersed Chitosan Microspheres with Controllable Structures. Adv. Healthcare Mater., 1, 106-111 (2012).
[3] Zhu Y., et al. Microfluidic synthesis of thiourea modified chitosan microsphere of high specific surface area for heavy metal wastewater treatment, Chin. Chem. Lett.,28, 633-641 (2016).
[4] Xu, J.H., et al. Preparation of monodispersed chitosan microspheres and in situ encapsulation of BSA in a co-axial microfluidic device. Biomed Microdevices, 11, 243–249 (2009).
本實驗方案通過利用微滴/微球制備儀，以Drop-Surf微滴生成油為油相，以5%殼聚糖為水相制備高單分散的微滴，并與接收液油相中的戊二醛發(fā)生Schiff堿反應實現微滴的固化。最終獲得具有極高的單分散性的殼聚糖微球(CV<5%)。
引言：
殼聚糖是一種功能線性聚合物，是由甲殼素部分去乙�；�[1-3]。因其來源廣泛、無毒、價格低廉、良好的生物相容性和可降解而備受關注。近年來，殼聚糖作為一種新型功能材料，以纖維、膜、微球和膠囊等形式在蛋白吸附分離、催化劑載體、酶的固定化、重金屬吸附和藥物釋放等方面具有很大的應用潛力[2]。此外，殼聚糖在每個C6原子單元上都有一個游離的氨基，這使得殼聚糖可以與醛基發(fā)生Schiff堿反應，且在這一反應過程中生成的C=N鍵發(fā)生n-π*躍遷產生自發(fā)熒光[2]。而這種熒光恰恰可以應用于血液循環(huán)追蹤、細胞外基質表征、體內細胞成像等領域。因此，殼聚糖在生物、醫(yī)藥、化學和環(huán)境等領域都有良好的應用前景。
殼聚糖微球粒徑的均一度控制對其在生物、醫(yī)藥和催化等領域的成功應用至關重要。目前制備殼聚糖微球的方法有乳化固化、簡單凝聚、復合凝聚和膜乳化等[2,4]。雖然這些技術完全可行，但也存在著很大的缺點，如產率不穩(wěn)定、程序復雜、粒徑分布不均和重復性差等。因此，開發(fā)一種可重復、粒徑及均勻度可控的殼聚糖微球制備技術是其成功應用的必要條件。FluidicLab微滴制備平臺運用液滴微流控技術，通過微滴/微球制備儀制備高度均一的殼聚糖微滴，再與戊二醛發(fā)生Schiff堿反應實現微滴的固化，最終得到殼聚糖微球。該法操作簡便，樣品利用率高，制備得到的微球單分散性高(CV<5%)，具有較好重復性。
實驗材料：
| 試劑 | 微滴生成油(Drop-Surf，FluidicLab) |
| 破乳劑(Drop-Surf，FluidicLab) | |
| 殼聚糖(FluidicLab) | |
| 冰乙酸(Macklin, A801295-500 mL) | |
| 戊二醛(50%, Aladdin, G105905-500 mL) | |
| 耗材 | 15 mL離心管(Falcon 15 mL REF 352097)若干 |
| 1.5 mL離心管若干 | |
| 內/外徑0.25 /1.6 mm PEEK管及所需接頭 | |
| 10 mL和20 mL透明玻璃瓶若干 | |
| 0.22 μm針式過濾器(PTFE材質)若干 | |
| 10 mL注射器若干 | |
| 芯片夾具 | PDMS-FF-100 μm 芯片（FluidicLab） |
| PDMS標準芯片夾具 | |
| 設備 | Fluidiclab微滴/微球制備儀(兩通道) |
| 輔助設備 | 電腦(Win10 以上系統(tǒng)) |
| 高速離心機(湖南湘儀, H1850) | |
| 普通光學顯微鏡(用于測微球粒徑) |
實驗步驟：
- 試劑配制：
- 5%(wt%)殼聚糖水溶液：
- 1%戊二醛油相溶液：
2. 微滴制備：
微滴/微球制備儀的安裝連接
微滴/微球制備儀安裝連接參考《微滴/微球制備儀使用手冊V.1.0》中“2. 微滴/微球制備儀的安裝連接”的部分；其連接如下(步驟③-⑦連接效果如下圖所示)：
① 用氣管依次連接“空氣壓縮機”--“氣源處理裝置”--“微滴/微球制備儀”；
② 將微滴/微球制備儀分別與電源、電腦的連接；
③ 用氣管分別將A0(壓力輸出通道一)和A1(油相15 mL儲液池)，B0(壓力輸出通道二)和B1(水相1.5 mL儲液池)連接；
④ 用配有1/4-28螺紋接頭和卡箍的PEEK管(內/外徑 0.25 mm/1.6 mm)分別將A1(油相15 mL儲液池)和A2(通道一流量傳感器)，B1(水相1.5 mL儲液池)和B2(通道二流量傳感器)連接；
⑤ 用配有1/4-28螺紋接頭和卡箍的PEEK管(內/外徑 0.25 mm/1.6 mm)分別將A2(通道一流量傳感器)和A3(PDMS芯片的油相入口)，B2(通道二流量傳感器)和B3(PDMS芯片的水相入口)連接；
⑥ C為標準PDMS芯片和夾具的組合，芯片和夾具的入口通過硅膠塞密封；
⑦ 用PEEK管(內/外徑 0.25 mm/1.6 mm)將芯片出口D處生成的乳液導出。
FluidicLabSuite軟件的安裝參考《微滴/微球制備儀使用手冊V.1.0》中“3.1 FluidicLabSuite軟件的安裝”的部分；
3. 殼聚糖微液滴的制備：
具體操作步驟如下(參考視頻“微流控應用：微滴生成儀制備殼聚糖微球”)：
① 分別在15 mL油相儲液池(通道一)和1.5 mL水相儲液池(通道二)中依次加入5 mL微滴生成油和1 mL 5%的殼聚糖水溶液；
② FluidicLabSuite軟件的設備添加參考《微滴/微球制備儀使用手冊V.1.0》中“3.2 FluidicLabSuite軟件的設備添加”的部分(相機和流量傳感器僅需添加一次)；
③ 打開空氣壓縮機和氣源處理裝置開關；
④ 在乳液出口端放置離心管接收微滴穩(wěn)定前的廢液；
⑤ 在電腦端設置通道一壓力(油相，如150 mbar)和通道二壓力(水相，如900 mbar，水相黏度大，流阻大，壓力更大)排出管路和芯片中的空氣；
⑥ 待管路和芯片中完全填充液體后(空氣被完全排出)；將整個系統(tǒng)由壓力控制切換到流速控制，并設置通道一(油相)和通道二(水相)流速分別為20和5 μL/min；
⑦ 調整反饋值(Feedback)快速達到設定流速，并實現流速的穩(wěn)定輸出；
⑧ 用疏水培養(yǎng)皿接收一滴乳液，并在普通光學顯微鏡下觀察其微滴的均勻性；
⑨ 待微滴生成均勻后，即可開始接收至裝有1%戊二醛油相溶液的1.5 mL離心管中；
⑩ 20 min后停止收集，密封于離心管中，輕微振蕩加快微滴固化，隨后靜置一段時間。
3. 殼聚糖微球的破乳清洗：
具體操作步驟如下(參考視頻“微流控應用：微滴生成儀制備殼聚糖微球”)：
① 取出1.5 mL離心管底部微滴生成油；
② 按V球：V破=1:2 加入破乳劑，振蕩破乳；
③ 2500 rpm離心處理1 min，并取出底部破乳劑；
④ 重復上述②和③操作；
⑤ 最終得到固化后的殼聚糖微球。
4. 微滴/微球制備儀清洗：
微滴生成儀每次使用完必須清洗管路、流量傳感器和芯片。
具體操作詳見“微滴/微球制備儀操作指導卡”。
結果與討論：
剛接收的微滴平均粒徑為107.53 μm，具有極高的單分散性(變異系數:CV=2.14%)。其顯微鏡圖和粒徑分布如下圖所示：
參考文獻：
[1] Zhao H., et al. A novel microfluidic approach for monodispersed chitosan microspheres with enhanced autofluorescence, Chem. Eng. J., 215–216, 784-790 (2013).
[2] Xu, J.H., et al. A Novel Microfluidic Approach for Monodispersed Chitosan Microspheres with Controllable Structures. Adv. Healthcare Mater., 1, 106-111 (2012).
[3] Zhu Y., et al. Microfluidic synthesis of thiourea modified chitosan microsphere of high specific surface area for heavy metal wastewater treatment, Chin. Chem. Lett.,28, 633-641 (2016).
[4] Xu, J.H., et al. Preparation of monodispersed chitosan microspheres and in situ encapsulation of BSA in a co-axial microfluidic device. Biomed Microdevices, 11, 243–249 (2009).
