D-螢光素鉀鹽生物發(fā)光的作用原理及使用注意事項(xiàng)

D-熒光素 (D-Luciferin) 是熒光素酶的常用底物。D-熒光素利用熒光素酶報(bào)告基因在活體內(nèi)表達(dá)產(chǎn)生的熒光蛋白發(fā)生化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生熒光，從而使用高靈敏度的光學(xué)檢測(cè)儀器檢測(cè)動(dòng)物活體體內(nèi)的細(xì)胞活動(dòng)和基因行為，普遍應(yīng)用于生物領(lǐng)域，特別是生物活體成像技術(shù)。
 

一，D-螢光素生物發(fā)光的作用原理

D-熒光素能夠在熒光素酶和ATP的作用下氧化成 oxyluciferin，在氧化過(guò)程中能夠?qū)⒒瘜W(xué)能轉(zhuǎn)化為光能，從而發(fā)出波長(zhǎng)為 560 nm 左右的生物熒光 (圖1)。將攜帶熒光素酶編碼基因 (Luc) 的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入細(xì)胞后，接種到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 (如小鼠) 體內(nèi)，當(dāng)外源 (腹腔或靜脈等注射) 給予其底物D-熒光素，即可通過(guò)生物發(fā)光成像技術(shù) (BLI) 來(lái)檢測(cè)光強(qiáng)度變化，從而實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)疾病發(fā)展?fàn)顟B(tài)，或藥物的治療效果等。

二，逐典D-螢光素鉀鹽優(yōu)勢(shì)

1.高純度（HPLC驗(yàn)證純度≥99%)

2.優(yōu)異的生物發(fā)光性能

3.高溶解度（>40mg/ml)

三，應(yīng)用場(chǎng)景

D-熒光素鉀鹽在不同領(lǐng)域具有多種應(yīng)用場(chǎng)景。其中包括蛋白表達(dá)研究、抗腫瘤或抗病毒藥物研究以及mRNA疫苗開(kāi)發(fā)等。

蛋白表達(dá)研究：將Luc基因插入需要研究的蛋白中，可用于定量目標(biāo)蛋白在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)的表達(dá)情況。

抗腫瘤或抗病毒藥物：在腫瘤細(xì)胞或病毒中導(dǎo)入Luc基因，建立腫瘤或病毒感染小鼠模型，注射藥物后，通過(guò)活體成像技術(shù)觀(guān)測(cè)腫瘤大小或病毒感染的變化。

mRNA疫苗開(kāi)發(fā)：在mRNA中插入Luc基因，脂質(zhì)體包裹后注射實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后，可通過(guò)活體成像技術(shù)可觀(guān)測(cè)疫苗的免疫效果。

四，客戶(hù)之聲

五，常見(jiàn)問(wèn)題答疑

Q:D-螢光素鉀鹽的純度是多少？純度大小對(duì)實(shí)驗(yàn)有影響嗎？

A:D-螢光素鉀鹽純度≥99 %，螢光素純度越高，相應(yīng)污染物含量越低，相反則越高，污染物濃度過(guò)高將抑制某些酶和細(xì)胞中的生物學(xué)過(guò)程，可能會(huì)給實(shí)驗(yàn)結(jié)果帶來(lái)偏差，并且可能會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造成傷害。

Q:D-螢光素鉀鹽溶解度是多少？其溶液穩(wěn)定嗎？

A:D-螢光素鉀鹽溶解度在40 mg/ml以上，其水溶液短期內(nèi)存放于-80℃，對(duì)實(shí)驗(yàn)效果沒(méi)有明顯影響。對(duì)于部分條件較敏感的實(shí)驗(yàn)，為了控制實(shí)驗(yàn)中的可變因素，推薦反應(yīng)液新鮮配制。例如，熒光素酶過(guò)低、非最適的反應(yīng)條件等都需要高質(zhì)量的底物才能進(jìn)行反應(yīng)。

Q:D-螢光素鉀鹽的建議用量是多少？

A:活體成像：以10 μL/g體重確定注射量。每只小鼠接受150 mg D-螢光素鉀鹽/kg體重（如對(duì)于體重為10 g的小鼠，需要注射100 μL以提供1.5 mg D-螢光素鉀鹽）。

體外成像：一般使用150μg/ml的工作液用于體外細(xì)胞成像。

Tips: 注射方式、動(dòng)物類(lèi)型以及體重等都會(huì)影響信號(hào)的發(fā)射，需要適當(dāng)摸索，待螢光信號(hào)達(dá)到最強(qiáng)穩(wěn)定平臺(tái)期，再用相應(yīng)儀器進(jìn)行成像分析。

Q:配置好的D-螢光素鉀鹽溶液如何儲(chǔ)存？

A:工作液現(xiàn)配現(xiàn)用，理想情況下，配置好的儲(chǔ)存液可于-20℃儲(chǔ)存較短時(shí)間。如有必要，螢光素溶液可在-20℃儲(chǔ)存長(zhǎng)達(dá)3周。

Tips: 上述溶液在任何一種溫度長(zhǎng)時(shí)間貯存下都有可能導(dǎo)致信號(hào)退化哦！

Q:螢光素（酶）底物的形式有哪些？

A:分為D-螢光素游離酸、D-螢光素鉀鹽和D-螢光素鈉鹽，由于水溶性高，因此鉀鹽和鈉鹽通常是最通用的兩種檢測(cè)底物，其中又以鉀鹽作為活體動(dòng)物檢測(cè)使用的主要形式。

Q:如何確定不同模型的峰值信號(hào)時(shí)間?

A:生物發(fā)光信號(hào)的動(dòng)力學(xué)具有組織依賴(lài)性。建議每5-10min對(duì)動(dòng)物進(jìn)行一次成像，最多40 min，為每個(gè)新模型創(chuàng)建一個(gè)動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)。(常見(jiàn)信號(hào)峰值時(shí)間點(diǎn)在10-15 min左右，螢光反應(yīng)發(fā)光一般在30 min后衰減，3 h后完全消失。)具體詳見(jiàn)逐典D-螢光素鉀鹽說(shuō)明書(shū)“螢光素動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)制備”。

Q:螢光素底物可以透過(guò)血腦屏障嗎？

A:螢光素底物約280 Da，螢光素的水溶性和脂溶性都非常好，很容易穿透細(xì)胞膜和血腦屏障。

Q:螢光素酶的表達(dá)穩(wěn)定性如何？

A:螢光素酶基因能夠通過(guò)穩(wěn)定篩選等過(guò)程插到細(xì)胞染色體內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)行分裂、轉(zhuǎn)移、分化從而進(jìn)行持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)，螢光素酶的半衰期約為3 h，故只有活細(xì)胞才能持續(xù)表達(dá)螢光素酶。