基因編輯入門級(jí)知識(shí)點(diǎn)介紹

一、什么是基因編輯？

基因編輯是指通過基因編輯技術(shù)對(duì)生物體基因組特定目標(biāo)進(jìn)行修飾的過程，可以精確地定位到基因組的某一位點(diǎn)上，在該位點(diǎn)上可以進(jìn)行特定DNA片段的插入、缺失、修改和替換，從而改變其遺傳信息和表現(xiàn)型特征，最終應(yīng)用于人類疾病治療、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、基因功能研究等多個(gè)領(lǐng)域。

基因編輯技術(shù)主要分為基因敲除、基因插入、基因突變和基因重組等四種技術(shù)。其中，基因敲除技術(shù)是最常用的，它的原理是通過CRISPR/Cas9等基因切割工具，將某個(gè)基因的特定序列剪切掉，使其失去功能，從而達(dá)到改變物種特征的目的�；�因插入技術(shù)則是將外源基因插入到特定位置，使其成為物種的一部分，從而改變物種的特征�；�因突變技術(shù)是指通過基因編輯技術(shù)，引入一定的突變，使基因的功能發(fā)生改變，從而改變物種的特征。最后，基因重組技術(shù)則是通過對(duì)基因的重組，改變基因的結(jié)構(gòu)，從而達(dá)到改變物種特征的目的。

基因編輯技術(shù)發(fā)展迅速，其中CRISPR-Cas9技術(shù)是最常用的基因編輯工具之一，已經(jīng)在許多生物體中實(shí)現(xiàn)了基因編輯。這項(xiàng)技術(shù)的出現(xiàn)為許多遺傳性疾病的治療帶來了希望，同時(shí)也在農(nóng)業(yè)、生態(tài)學(xué)等領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力。

 

二、基本步驟

基因編輯的過程通常包括以下步驟：

1. 選取目標(biāo)基因：根據(jù)研究需求選擇特定的基因作為目標(biāo)基因。

2. 設(shè)計(jì)基因編輯器：根據(jù)目標(biāo)基因的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)相應(yīng)的基因編輯器，包括指導(dǎo)RNA和Cas9蛋白等。

3. 導(dǎo)入基因編輯器：將基因編輯器導(dǎo)入到生物體內(nèi)，使其能夠準(zhǔn)確地找到目標(biāo)基因。

4. 激活基因編輯器：在合適的時(shí)間和條件下，激活基因編輯器，使其能夠?qū)δ繕?biāo)基因進(jìn)行修飾。

5. 檢測(cè)和驗(yàn)證：對(duì)經(jīng)過基因編輯的生物體進(jìn)行檢測(cè)和驗(yàn)證，確認(rèn)基因編輯是否成功，并評(píng)估其表型和遺傳變化。

 

三、基因編輯器是什么？

基因編輯器是指用于對(duì)生物體基因組進(jìn)行修飾和改造的工具，其中最常見的是CRISPR-Cas9系統(tǒng)。

CRISPR-Cas9系統(tǒng)由兩部分組成：Cas9蛋白和指導(dǎo)RNA（sgRNA）。其中，Cas9蛋白是一種能夠切割DNA的酶，而指導(dǎo)RNA則能夠引導(dǎo)Cas9蛋白找到目標(biāo)基因組序列并對(duì)其進(jìn)行切割。通過設(shè)計(jì)特定的指導(dǎo)RNA，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因組的定點(diǎn)修飾，包括插入、缺失、修改和替換等操作。

除了CRISPR-Cas9系統(tǒng)外，還有其他類型的基因編輯器，如ZFNs（鋅指核酸酶）和TALENs（轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)物核酸酶）等。這些基因編輯器也都是通過對(duì)目標(biāo)基因組進(jìn)行修飾，從而實(shí)現(xiàn)改變生物體遺傳信息和表現(xiàn)型特征的目的。

 

四、 基因編輯中的CRISPR技術(shù)是什么？

CRISPR技術(shù)是一種基因編輯技術(shù)，可以用來對(duì)生物體的基因進(jìn)行精確的編輯。該技術(shù)的中文名是“基因剪刀”。

CRISPR-Cas9系統(tǒng)是由兩部分組成的：一個(gè)是向?qū)�RNA，它能夠精確地找到目標(biāo)基因，另一個(gè)是Cas9蛋白，它就像一個(gè)精準(zhǔn)的剪刀，能夠?qū)⒛繕?biāo)基因準(zhǔn)確地剪切下來。

首先，向?qū)�RNA與Cas9蛋白結(jié)合，形成一個(gè)復(fù)合體。然后，這個(gè)復(fù)合體被引導(dǎo)到目標(biāo)基因的位置。Cas9蛋白會(huì)與目標(biāo)基因結(jié)合，并剪切下這段基因。

剪切下來的基因可以被科學(xué)家重新編輯，比如替換某個(gè)堿基對(duì)、插入新的基因序列或者刪除某個(gè)基因片段。一旦編輯完成，新的基因序列會(huì)被引導(dǎo)回原來的位置，并插入到原來的基因組中。

CRISPR-Cas9技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于它的高精度和高效率。與之前的基因編輯技術(shù)相比，CRISPR-Cas9技術(shù)可以更準(zhǔn)確地找到目標(biāo)基因，并且可以更高效地編輯基因。

此外，CRISPR-Cas9技術(shù)也具有廣泛的應(yīng)用前景。它不僅可以用于治療遺傳性疾病，還可以用于治療癌癥、神經(jīng)性疾病以及其它許多疾病。

 

五、 向?qū)�RNA有哪些？

1. sgRNA（單向?qū)�RNA）：sgRNA是CRISPR-Cas9基因編輯工具中的一種特殊類型的向?qū)�RNA。它通過將crRNA和tracrRNA融合為一條單一的RNA分子，提高效率和便于生產(chǎn)。sgRNA 5′端20 bp序列是與靶序列互補(bǔ)配對(duì)的序列，如果編輯某個(gè)靶位點(diǎn)，只需要改變這20 bp的序列就可以實(shí)現(xiàn)。

2. crRNA（向?qū)�RNA的靶向序列）：在CRISPR-Cas9系統(tǒng)中，crRNA主要負(fù)責(zé)提供與目標(biāo)基因互補(bǔ)配對(duì)的序列。這個(gè)序列全長(zhǎng)并不與Cas9蛋白結(jié)合，只有其中20nt的部分序列在Cas9蛋白剪切DNA時(shí)提供目標(biāo)序列的信息。

3. tracrRNA（向?qū)�RNA的非特異性導(dǎo)向序列）：tracrRNA主要與Cas9蛋白結(jié)合并形成復(fù)合物，幫助Cas9蛋白尋找目標(biāo)基因。其主要功能是提供一種"通用"的導(dǎo)向序列，與不同的crRNA配對(duì)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)多種基因進(jìn)行編輯。

此外，某些文獻(xiàn)中還提到了一種叫做Alt-R® CRISPR-Cas9系統(tǒng)的向?qū)�RNA類型。該系統(tǒng)使用的crRNA和tracrRNA序列模擬的是化膿性鏈球菌的序列，為了提高效率和便于生產(chǎn)，已經(jīng)對(duì)其長(zhǎng)度進(jìn)行了優(yōu)化。這種系統(tǒng)使用的sgRNA是通過人的RNA聚合酶Ⅲ啟動(dòng)子U6起始表達(dá)的，這個(gè)啟動(dòng)子起始轉(zhuǎn)錄的第一堿基必須是G。

 

六、 CRISPR-Cas9的實(shí)驗(yàn)流程有哪些？

1. 設(shè)計(jì)sgRNA：首先需要確定要編輯的目標(biāo)基因序列，并設(shè)計(jì)針對(duì)該序列的特異性sgRNA（單向?qū)�RNA），該sgRNA與Cas9蛋白結(jié)合，引導(dǎo)其到目標(biāo)基因的特定位置進(jìn)行剪切。（像我們這邊，您可以提供要編輯的目的基因序列，會(huì)有對(duì)應(yīng)的合成好的sgRNA挑選）

2. 構(gòu)建sgRNA-Cas9載體：將sgRNA和Cas9蛋白一起嵌入到一個(gè)可自我復(fù)制的病毒載體中，以便將sgRNA-Cas9復(fù)合物轉(zhuǎn)入到目標(biāo)細(xì)胞中。

3. 構(gòu)建sgRNA-Cas9穩(wěn)轉(zhuǎn)株：通過將sgRNA-Cas9載體轉(zhuǎn)染至目標(biāo)細(xì)胞，并經(jīng)過多輪篩選和擴(kuò)增，得到穩(wěn)定表達(dá)sgRNA-Cas9的細(xì)胞株，即sgRNA-Cas9穩(wěn)轉(zhuǎn)株。
（針對(duì)這一步。我們有對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)染試劑供您挑選）

4. 篩選細(xì)胞克隆并進(jìn)行qPCR驗(yàn)證：在sgRNA-Cas9穩(wěn)轉(zhuǎn)株中篩選出基因敲除成功的細(xì)胞克隆，通過qPCR（定量PCR）技術(shù)對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)水平檢測(cè)，以驗(yàn)證基因敲除成功。

5. 陽性克隆測(cè)序，選擇敲除純合細(xì)胞株：對(duì)陽性克隆進(jìn)行全基因組測(cè)序，精確檢測(cè)基因敲除的位置和大小，并挑選敲除純合細(xì)胞株進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

6. 篩選細(xì)胞單克隆測(cè)序：在敲除純合細(xì)胞株中篩選單克隆細(xì)胞，并進(jìn)行全基因組測(cè)序，以確�；�因敲除的準(zhǔn)確性和一致性。

除了以上流程，實(shí)驗(yàn)流程可能還包含其他內(nèi)容，比如在轉(zhuǎn)染過程中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行觀察和記錄等。具體的實(shí)驗(yàn)流程可能會(huì)根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的、條件和要求而有所不同。

 

七、 基因編輯之CRISPR-Cas9技術(shù)試劑推薦

1. Dharmacon CRISPR Cas9——無需克隆，任性編輯

① Edit-R Cas9核酸酶，基因編輯成功的關(guān)鍵
高效的基因編輯需要Cas9核酸酶有效的表達(dá)，為了滿足不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛯?shí)驗(yàn)方法，盡可能適應(yīng)不同的實(shí)驗(yàn)體系，Dharmacon設(shè)計(jì)不同的Cas9核酸酶表達(dá)質(zhì)粒、Cas9核酸酶mRNA和Cas9核酸酶蛋白，滿足不同實(shí)驗(yàn)對(duì)象和實(shí)驗(yàn)環(huán)境對(duì)啟動(dòng)子活性、篩選標(biāo)記和實(shí)驗(yàn)手段的要求，保障實(shí)驗(yàn)的成功率，降低實(shí)驗(yàn)工作量。

1）Cas9 nuclease mRNA
☆ DNA-free系統(tǒng)消除了將不需要的外源DNA整合到宿主細(xì)胞基因組的可能性
☆ 熒光標(biāo)簽Cas9 mRNA（mKate2或EGFP）可富集基因編輯細(xì)胞群
☆ 瞬時(shí)表達(dá)Cas9核酸酶可減少脫靶，獲得更可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果
☆ Cas9啟動(dòng)子與細(xì)胞系間沒有不兼容的問題
☆ 使用DharmaFECT Duo轉(zhuǎn)染試劑輕松共轉(zhuǎn)染Edit-R sgRNA和Cas9 mRNA，或電轉(zhuǎn)染入難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞 

 

圖注：三種細(xì)胞系中Cas9核酸酶mRNA的基因編輯

 

2）Cas9 nuclease protein NLS
純化的Cas9核酸酶NLS蛋白提供了一種隨時(shí)可用的選擇，使研究人員能夠以完全無DNA的方式加速基因編輯實(shí)驗(yàn)

☆ 直接與sgRNA進(jìn)行共轉(zhuǎn)染或共電轉(zhuǎn)
☆ 沒有添加外源DNA到系統(tǒng)中，有效防止質(zhì)粒DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組的可能性   
☆ 啟動(dòng)子與細(xì)胞系間沒有不兼容的問題
☆ 瞬時(shí)表達(dá)Cas9核酸酶以減少脫靶  

 

圖注：Cas9 protein RNP nucleofection

 

② Edit-R predesigned All-in-one lentiviral sgRNA
☆ 將sgRNA和Cas9核酸酶表達(dá)結(jié)合成單個(gè)載體，簡(jiǎn)化遞送  
☆ 提供嘌呤霉素耐藥性和熒光分選標(biāo)記，可以選擇成功整合載體的細(xì)胞
☆ 算法優(yōu)化保證功能蛋白敲除最大化及脫靶編輯最小化 
☆ 提供甘油菌質(zhì)粒形式和高滴度純化病毒顆粒形式產(chǎn)品  
☆ 最常用于難轉(zhuǎn)染細(xì)胞類型的敲除，或用于混合慢病毒sgRNA文庫(kù)篩選后的后續(xù)敲除。  
☆ 建議將EGFP選擇標(biāo)記用于編輯細(xì)胞的快速富集，一旦熒光表達(dá)，就可以進(jìn)行FACS分析。適用于壽命較短的細(xì)胞類型，如原代細(xì)胞

 

圖注：Edit-R All-in-one慢病毒sgRNA載體示意圖

 

2. 其余試劑推薦

貨號(hào)	品名	規(guī)格	產(chǎn)品介紹
jetPRIME	101000046	1.5mL	• 通用型DNA/siRNA 轉(zhuǎn)染試劑 • 卓越的轉(zhuǎn)染效率：可用于不同來源的貼壁細(xì)胞 • 更好的細(xì)胞活率：極其溫和的轉(zhuǎn)染模式 • 性價(jià)比高：更少的DNA和轉(zhuǎn)染試劑使用量 • 操作步驟簡(jiǎn)單：血清，抗生素兼容
TransIT-X2® Dynamic Delivery system	MIR6000	1.5mL	• 高效——卓越的廣譜轉(zhuǎn)染 • 多功能——質(zhì)粒 DNA、siRNA/miRNA 或核糖核蛋白 (RNP) 復(fù)合物的遞送利刃 • 技術(shù)——新型非脂質(zhì)體聚合物遞送
DNeasy Blood & Tissue Kit (50)	69504	50T	從新鮮或冷凍的動(dòng)物組織和細(xì)胞、血液、細(xì)菌中提取基因組DNA
QIAamp DNA Mini Kit (50)	51304	50T	從細(xì)胞、組織中提取DNA
UCP HiFidelity PCR Kit（100）	202742	100T	高保真PCR Mix
2× Xerox PCR Master Mix	abs60034	1mL	高保真PCR Mix
DNA凝膠/PCR純化試劑盒	abs60098	50次	膠回收試劑盒
QIAquick Gel Extraction Kit (50)	28704	50T	用于從酶反應(yīng)中純化回收DNA或者用于膠回收，適用于DNA片段70bp-10kb
T7 Endonuclease I	P7062-1250U	1250U	用于識(shí)別錯(cuò)配DNA、四方向交叉DNA或分支DNA等

 

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