免疫熒光(IF)實驗樣本要求與實驗操作步驟介紹
免疫熒光(immunofluorescence，IF)，通常是指用熒光標記的抗體示蹤或檢查樣品中相應(yīng)抗原的方法。根據(jù)抗原抗體反應(yīng)，將不影響抗原抗體相互作用的熒光分子標記在抗體上，與其相應(yīng)的抗原反應(yīng)后，在熒光顯微鏡下針對熒光標記分子的激發(fā)光發(fā)射光進行觀察，從而檢測目的指標的相對含量、在組織細胞中的定位。
樣本準備要求：
1、取材手法：要求取材器械鋒利，盡可能選擇薄的手術(shù)刀片，減少剪刀的使用，避免擠壓挫傷標本。較準確地取到目的部位組織，夾取標本的時候盡量遠離目的區(qū)域組織。
2、取材速度：盡量保證樣本離體后5min內(nèi)放入到合適的固定液內(nèi)。如果一只動物同時取多種器官，優(yōu)先取消化器官，其次取中樞神經(jīng)系統(tǒng)器官(腦，脊髓等)，皮膚、肌肉等可放到最后取。
3、組織塊大�。何唇�(jīng)灌注的標本組織厚度不要超過1cm。
4、固定液：針對不同的標本特點及實驗?zāi)康囊欢ㄒx用正確的固定液。
5、固定液量：固定液體積為組織的10倍，且組織能在容器內(nèi)自由移動，不貼壁不沉底，并做好清晰標記。
6、固定溫度：常溫即可，無需冷藏，切勿冷凍結(jié)冰，否則固定液結(jié)冰形成冰晶嚴重破壞組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。
樣本準備要求：
1、取材手法：要求取材器械鋒利，盡可能選擇薄的手術(shù)刀片，減少剪刀的使用，避免擠壓挫傷標本。較準確地取到目的部位組織，夾取標本的時候盡量遠離目的區(qū)域組織。
2、取材速度：盡量保證樣本離體后5min內(nèi)放入到合適的固定液內(nèi)。如果一只動物同時取多種器官，優(yōu)先取消化器官，其次取中樞神經(jīng)系統(tǒng)器官(腦，脊髓等)，皮膚、肌肉等可放到最后取。
3、組織塊大�。何唇�(jīng)灌注的標本組織厚度不要超過1cm。
4、固定液：針對不同的標本特點及實驗?zāi)康囊欢ㄒx用正確的固定液。
5、固定液量：固定液體積為組織的10倍，且組織能在容器內(nèi)自由移動，不貼壁不沉底，并做好清晰標記。
6、固定溫度：常溫即可，無需冷藏，切勿冷凍結(jié)冰，否則固定液結(jié)冰形成冰晶嚴重破壞組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。
實驗流程圖
操作步驟：
1、細胞準備：對單層生長細胞，在傳代培養(yǎng)時，將細胞接種到預(yù)先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細胞接近長成單層后取出蓋玻片，PBS洗兩次；對懸浮生長細胞，取對數(shù)生長細胞，用PBS離心洗滌（1000rpm,5min）2次，用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞涂片。
2、固定：根據(jù)需要選擇適當?shù)墓潭▌┕潭毎�。固定完畢后的細胞可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個月。PBS洗滌3×5 min.
3、通透：使用交聯(lián)劑（如多聚甲醛）固定后的細胞，一般需要在加入抗體孵育前，對細胞進行通透處理，以保證抗體能夠到達抗原部位。選擇通透劑應(yīng)充分考慮抗原蛋白的性質(zhì)。通透的時間一般在5-15min.通透后用PBS洗滌3×5 min.
4、封閉：使用封閉液對細胞進行封閉，時間一般為30min.
5、一抗結(jié)合：室溫孵育1h或者4℃過夜。PBST漂洗3次，每次沖洗5min.
6、二抗結(jié)合：間接免疫熒光需要使用二抗。室溫避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次沖洗5min后，再用蒸餾水漂洗一次。
7、封片及檢測：滴加封片劑一滴，封片，熒光顯微鏡檢查。
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