免疫組化操作步驟及實驗問題解決方案分析

免疫組化，免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemistry)是一項利用抗原抗體反應(yīng)，通過使標記抗體的顯色劑顯色來確定組織細胞內(nèi)抗原，對蛋白定位，定性的實驗技術(shù)。

免疫組化主要用的是組織標本和細胞標本兩大類，組織標本包括石蠟切片（病理切片和組織芯片）和冰凍切片。

石蠟切片，對組織形態(tài)保存好，保存時間也長，雖然對組織抗原暴露有影響，但可以抗原修復(fù)，所以石蠟切片仍然是首選的標本制作方法。

一、免疫組化操作步驟：

1、在60°烤箱烤片30~60min，這一步是為了使蠟片水分蒸發(fā)和石蠟融化，好讓組織切片牢固貼在玻片上。做切片是免疫組化的前提切片子最好是找專業(yè)培訓(xùn)郭的人員切片，片子的厚薄均勻，切片的完整，無褶無刀痕。

2、脫蠟水化，依次放入二甲苯I、II、III各10min，乙醇梯度（高至低）各2min，水。然后用自來水洗一下，但不要直接對著切片沖洗。

3、抗原修復(fù)，小編用的是高壓熱修復(fù)，ph6.0的檸檬酸鹽緩沖液，一定要全部浸泡切片，等高壓鍋冒氣后5min結(jié)束，自然冷卻，溫度劇降可能引起脫片哦。3%H202避光浸泡15min。

4、用免疫組化油筆圍繞組織畫圈，接下來就能看見它的功效了。PBS洗5min*3次。PBS會被鎖在畫的圈中，不會流干，保證不干片。

二、問題分析：

1、免疫組化實驗所用的組織和細胞標本有哪些？

實驗所用主要為組織標本和細胞標本兩大類，前者包括石蠟切片（病理大片和組織芯片）和冰凍切片，后者包括組織印片、細胞爬片和細胞涂片。其中石蠟切片是制作組織標本最常用、最基本的方法，對于組織形態(tài)保存好，且能作連續(xù)切片，有利于各種染色對照觀察；還能長期存檔，供回顧性研究；石蠟切片制作過程對組織內(nèi)抗原暴露有一定的影響，但可進行抗原修復(fù)，是免疫組化中首選的組織標本制作方法。

2、石蠟切片為什么要做抗原修復(fù)？有哪些方法？

石蠟切片標本均用甲醛固定，使得細胞內(nèi)抗原形成醛鍵、羧甲鍵而被封閉了部分抗原決定簇，同時蛋白之間發(fā)生交聯(lián)而使抗原決定簇隱蔽。所以要求在進行IHC染色時，需要先進行抗原修復(fù)或暴露，即將固定時分子之間所形成的交聯(lián)破壞，而恢復(fù)抗原的原有空間形態(tài)。常用的抗原修復(fù)方法有微波修復(fù)法，高壓加熱法，酶消化法，水煮加熱法等，常用的修復(fù)液是pH6.0的0.01 mol/L的檸檬酸鹽緩沖液。

3、免疫組化常用的染色方法有哪些？

根據(jù)標記物的不同分為免疫熒光法，免疫酶標法，親和組織化學(xué)法，后者是以一種物質(zhì)對某種組織成分具有高度親合力為基礎(chǔ)的檢測方法。這種方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗體)在細胞或亞細胞水平的定位，其中生物素——抗生物素染色法最常用。

4、石蠟切片在染色過程中出現(xiàn)脫片現(xiàn)象

1）烤片時間不夠，或溫度不夠，可以延長烤片時間和提高烤片溫度； 

2）用含有多聚賴氨酸的玻片，可以購買到或這自己做；

3）有些組織本身就容易掉片，如骨組織等，操作時沖PBS不要直接沖到組織上，沖到組織上方，讓它流下沖洗組織； 

4）用高溫修復(fù)時，溫度驟冷也可能引起。 

5、邊緣效應(yīng)

1）組織邊緣與玻片粘貼不牢，邊緣組織松脫漂浮在液體中，每次清洗不易將組織下面試劑洗盡所致. 解決辦法：制備優(yōu)質(zhì)的膠片（APES或多聚賴氨酸），切出盡量薄的組織切片，不厚于4微米，組織的前期處理應(yīng)規(guī)范，盡量避免選用壞死較多的組織；

2）切片上滴加的試劑未充分覆蓋組織，邊緣的試劑容易首先變干，濃度較中心組織高而致染色深。解決辦法：試劑要充分覆蓋組織，應(yīng)超出組織邊緣2mm。用組化筆畫圈時，為了避免油劑的影響，畫圈應(yīng)距組織邊緣3-4mm。 

6、產(chǎn)生組織切片非特異性染色

1）抗體孵育時間過長、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過縮短一抗/二抗孵育時間、稀釋抗體來控制。這是最重要的一條； 

2）一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看； 

3）內(nèi)源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細胞多的組織），需要通過延長滅活時間和增加滅活劑濃度來降低背景染色； 

4）非特異性組分與抗體結(jié)合，這需要通過延長二抗來源的動物免疫血清封閉時間和適當增加濃度來加強封閉效果； 

5）DAB孵育時間過長或濃度過高； 

6）PBS沖洗不充分，殘留抗體結(jié)果增強著色，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤為重要； 

7）標本染色過程中經(jīng)常出現(xiàn)干片，這容易增強非特異性著色。 

7、免疫組化染色呈陰性結(jié)果

1）抗體濃度和質(zhì)量問題以及抗體來源選擇錯誤；   

2）抗原修復(fù)不全，對于甲醛固定的組織必須用充分抗原修復(fù)來打開抗原表位，以利于與抗體結(jié)合；建議微波修復(fù)用高火4次*6min試試。有人做過實驗，這是最佳的時間和次數(shù)。若不行，還可高壓修復(fù)； 

3）組織切片本身這種抗原含量低；

4）血清封閉時間過長；

5）DAB孵育時間過短；

6）細胞通透不全，抗體未能充分進入胞內(nèi)參與反應(yīng)；

7）開始做免疫組化，我建議你一定要首先做個陽性對照片，排除抗體等外的方法問題。 

8、背景

1）考慮一抗?jié)舛雀撸?br />
2）然后調(diào)整DAB孵育時間；

3）也要考慮血清封閉時間是否過短；

4）適當增加抗體孵育后的浸洗次數(shù)和延長浸洗時間等。