案例分享：利用平行生物反應(yīng)器進(jìn)行米曲霉發(fā)酵工藝優(yōu)化

 

米曲霉（Aspergillus oryzae）屬于好氧性絲狀真菌，其菌落生長(zhǎng)快，質(zhì)地疏松，最初為白色，后變?yōu)辄S綠、綠色或深綠色（圖1）。分生孢子起初呈現(xiàn)橢圓形或洋梨形，待成熟后大多轉(zhuǎn)變?yōu)榍蛐位蛘呓�球形。分生孢子頭呈放射狀存在，少數(shù)為疏松柱形（圖2）^[1]。

圖1 米曲霉平板涂布圖

 

米曲霉已被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局FDA認(rèn)證為普遍安全菌株（GRAS）。在我國(guó)，米曲霉主要用作釀造食品醬、醬油和各類酒，也可用于生產(chǎn)各類益生素、有機(jī)酸、各類動(dòng)物飼料、酶制劑等。在眾多工業(yè)化生產(chǎn)菌株中，米曲霉占有重要地位^[2]。

 

圖2 米曲霉在顯微鏡下的菌體狀態(tài)

 

米曲霉固體發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，且反應(yīng)條件不易控制，重復(fù)性較差，而液體發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間相對(duì)較少，反應(yīng)條件容易實(shí)時(shí)監(jiān)控，易于工業(yè)擴(kuò)大化生產(chǎn)^[3]。

 

本文采用迪必爾生物的CloudReady™云平臺(tái)平行生物反應(yīng)器，驗(yàn)證了不同碳源對(duì)米曲霉培養(yǎng)的工藝優(yōu)化。結(jié)果顯示，在發(fā)酵培養(yǎng)對(duì)數(shù)期時(shí)，玉米糊精對(duì)米曲霉的菌體生長(zhǎng)更有利。但是在放罐時(shí)（112h），以葡萄糖和玉米粉為復(fù)合碳源的罐體呈現(xiàn)了最優(yōu)的結(jié)果，菌體濕重達(dá)到602.3g/L，為所有實(shí)驗(yàn)組的最高水平。本研究可為絲狀真菌的液體發(fā)酵提供數(shù)據(jù)支持。

 

研究方法

 

實(shí)驗(yàn)菌種：

米曲霉（As 3.863）購(gòu)自廣東省微生物菌種保藏中心。種子液孢子數(shù)：2.35×10⁷個(gè)/mL，接種量5%。

 

實(shí)驗(yàn)設(shè)備：

迪必爾生物CloudReady™1.5L×4云平臺(tái)平行生物反應(yīng)器。

 

工藝參數(shù)條件：見表2

 

 

結(jié)果和分析

 

本次培養(yǎng)周期為112h，其中在66h時(shí)，四個(gè)罐體自動(dòng)同步開始流加（2ml/h，50%葡萄糖）補(bǔ)料，且在89h后，自動(dòng)同步增加補(bǔ)料速度（15ml/h，50%葡萄糖）。

 

圖3 各罐不同時(shí)間發(fā)酵液狀態(tài)

 

圖4 各罐不同發(fā)酵時(shí)間菌體濕重

 

以玉米糊精為碳源的R1和R2，在40-64h期間，菌體濕重分別增加231.4g/L和211.1g/L，達(dá)到最大值。但是在流加補(bǔ)糖后，其增長(zhǎng)速度逐漸緩慢，甚至R2呈下降趨勢(shì)，這有可能是由于此時(shí)間段，碳源不同，導(dǎo)致米曲霉的代謝途徑不同，以至于消耗葡萄糖的速度不一致，產(chǎn)生糖阻遏現(xiàn)象。
 

 

從整體的結(jié)果可知，以葡萄糖和玉米粉為復(fù)合碳源的R4，在放罐時(shí)，菌體濕重最高，達(dá)到602.3g/L。這表明，在該補(bǔ)料速度的情況下，該復(fù)合碳源更適合米曲霉菌體的增殖。但是以玉米糊精為碳源的R1和R2的潛力不可忽視，除去補(bǔ)料速度對(duì)其產(chǎn)生的影響因素，玉米糊精對(duì)米曲霉的菌體增殖效果更加明顯，如果根據(jù)其自身的耗糖速度進(jìn)行補(bǔ)料速度的策略調(diào)整后，最終結(jié)果也是不可小覷的。

 

總結(jié)

本次實(shí)驗(yàn)基于CloudReady™1.5L×4云平臺(tái)平行生物反應(yīng)器具有良好的平行性這一優(yōu)勢(shì)，進(jìn)行了不同碳源或復(fù)合碳源的篩選（圖6），米曲霉的菌體濕重從40.2g/L增長(zhǎng)至602.3g/L，同時(shí)，我們也得到驗(yàn)證，米曲霉在發(fā)酵培養(yǎng)對(duì)數(shù)期時(shí)，玉米糊精更有利于菌體生長(zhǎng)。

 

圖6  T&J CloudReady™1.5L×4平行生物反應(yīng)器

 

迪必爾生物 應(yīng)用技術(shù)與工程研究中心CARE 管志欣供稿

 

參考文獻(xiàn)

[1]孟廣超.基于ARTP技術(shù)篩選高產(chǎn)氨肽酶米曲霉菌株及發(fā)酵和酶解條件優(yōu)化的研究[D].鄭州大學(xué),2021.DOI:10.27466/d.cnki.gzzdu.2021.002649

[2]劉琪聰.米曲霉蛋白酶與異源蛋白表達(dá)水平關(guān)系的研究[D].江西科技師范大學(xué),2022.DOI:10.27751/d.cnki.gjxkj.2022.000136

[3]王浩,盧梓熒,譚穎斯等.響應(yīng)面法優(yōu)化米曲霉液體發(fā)酵生產(chǎn)中性蛋白酶工藝[J].中國(guó)釀造,2017,36(12):40-45.