類器官疾病模型研究方法分享

基于多能干細(xì)胞和成體干細(xì)胞的器官再現(xiàn)被稱為類器官（Organoids），類器官是具有生理和分層細(xì)胞組織的三維（3D）細(xì)胞簇，可近似模擬配對人體器官。通過對多細(xì)胞通訊、細(xì)胞外基質(zhì)、遺傳操作、生長條件和其他因素的深入研究，代表各種器官類型的類器官已經(jīng)發(fā)展起來。隨著類器官培養(yǎng)的發(fā)展，患者來源的類器官可用于多種臨床應(yīng)用，包括疾病建模、藥物篩選、宿主-微生物相互作用和再生療法。基于慢病毒表達(dá)系統(tǒng)和CRISPR/Cas9基因編輯等技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)類器官疾病建模和靶向基因治療，患者來源類器官可以實(shí)現(xiàn)個(gè)性化醫(yī)療。本文重點(diǎn)介紹了類器官在疾病模型中的應(yīng)用及應(yīng)用中的限制，并提供了一種助力類器官培養(yǎng)與疾病建模的工具——JuLI™ Stage活細(xì)胞成像分析系統(tǒng)。

類器官概述

類器官（Organoids）指利用成體干細(xì)胞（Adult Stem Cells，ASC）或多能干細(xì)胞（Pluripotent Stem Cells，PSC）進(jìn)行體外三維（3D）培養(yǎng)而形成的具有一定空間結(jié)構(gòu)的組織類似物。類器官具有自組織能力，其結(jié)構(gòu)、形態(tài)和生理發(fā)展不受限制，為人類感染研究提供了新的工具。類器官模型概括了體內(nèi)組織器官的許多特征，為研究人類呼吸系統(tǒng)、胃腸道和神經(jīng)元宿主-微生物相互作用等提供了新的平臺。



圖1.類器官培養(yǎng)過程，Recent advances in organoid development and applications in disease modeling^[1]
干細(xì)胞衍生類器官對疾病進(jìn)行建模
相對來說，傳統(tǒng)的二維模型對全面理解胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、組織再生和疾病發(fā)展等復(fù)雜過程仍然有局限性。而類器官由于其自組織能力可以準(zhǔn)確地模擬器官的形態(tài)，且能更好地模擬器官在體內(nèi)的結(jié)構(gòu)和功能特異性，在多種領(lǐng)域具有巨大潛力。如通過建立腫瘤類器官進(jìn)行癌癥研究、誘導(dǎo)腸道類器官來模擬人類傳染病、遺傳性疾病和退行性疾病等。
類器官主要包括ASCs和iPSCs衍生的類器官，其特征取決于起始細(xì)胞類型，ASCs和iPSCs產(chǎn)生的類器官皆遵循不同的發(fā)育途徑。iPSCs衍生的類器官主要類似于早期胚胎發(fā)育，而ASCs衍生的類器官主要由特定的細(xì)胞類型組成。由于ASCs衍生的類器官可模擬成體器官穩(wěn)態(tài)，因此它們被廣泛用于疾病建模，如癌癥和神經(jīng)退行性疾��；iPSCs衍生的類器官則主要用于了解與發(fā)育相關(guān)的疾病。

疾病類型
1.傳染病
單細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物模型為闡明疾病條件下的宿主-病原體的相互作用提供了基礎(chǔ)。這些模型還推動(dòng)了用于治療傳染病的藥物和疫苗的開發(fā)。然而復(fù)雜的細(xì)胞環(huán)境以及人類和動(dòng)物之間免疫系統(tǒng)的固有差異限制了單細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物模型的使用，在此基礎(chǔ)上，3D類器官培養(yǎng)的進(jìn)步促進(jìn)了藥物開發(fā)，有助于了解傳染病和宿主細(xì)胞反應(yīng)。
誘導(dǎo)的人腸道類器官可以模擬其他宿主-微生物與病原體（如幽門螺桿菌和腸道沙門氏菌）的相互作用，同時(shí)可以在這些模型上進(jìn)行抗病毒/細(xì)菌治療測試。呼吸道傳染病通過呼吸道上皮進(jìn)入人體，氣道類器官培養(yǎng)可模擬呼吸道上皮，應(yīng)用于人類呼吸道感染研究，如利用肺類器官研究肺部病毒的感染。大腦類器官的發(fā)展對神經(jīng)系統(tǒng)感染的研究具有重大意義，在腦類器官模型中研究的病毒感染包括西尼羅河病毒 、單純皰疹病毒 、登革熱病毒 、水痘帶狀皰疹病毒和HIV等，這些大腦類器官模型表現(xiàn)出功能性突觸和活躍的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，顯示出樹突棘的特征，并具有與發(fā)育中的腦組織非常相似的轉(zhuǎn)錄譜^[2]。
2.癌癥
使用患者細(xì)胞來源的腫瘤類器官是體外癌癥建模的新領(lǐng)域。腫瘤類器官可以有效地從致瘤細(xì)胞、癌細(xì)胞系或從腫瘤中提取的細(xì)胞中產(chǎn)生，并且具有較高的可擴(kuò)增性，從而為研究人員提供足夠的材料來模擬特定形式甚至罕見類型的癌癥，并進(jìn)行大規(guī)模藥物開發(fā)和篩選。類器官細(xì)胞培養(yǎng)的空間和細(xì)胞結(jié)構(gòu)方面優(yōu)于傳統(tǒng)的癌癥模型，如細(xì)胞系或患者來源的異種移植模型。腫瘤類器官充分代表了患者腫瘤中的腫瘤異質(zhì)性，可用于預(yù)測體內(nèi)藥物敏感性和耐藥性^[3]。
3.遺傳性疾病
通過類器官模型模擬遺傳性疾病，研究尚不清楚的疾病機(jī)制。肝臟類器官可用于模擬常染色體顯性遺傳病ALGS（阿拉杰里綜合征），患者特異性 iPSCs衍生的肝臟類器官，可以觀察到明顯的管狀結(jié)構(gòu)，重現(xiàn)ALGS臨床表型，更好地用于人類遺傳性疾病的研究^[4]。
腫瘤微環(huán)境
腫瘤細(xì)胞作為類器官的體外培養(yǎng)通常由模擬腫瘤微環(huán)境的上皮細(xì)胞和基質(zhì)膠組成。實(shí)體瘤的很大一部分包括腫瘤微環(huán)境，涉及腫瘤浸潤免疫細(xì)胞、脈管系統(tǒng)和腫瘤基質(zhì)。多項(xiàng)研究證明了腫瘤微環(huán)境參與腫瘤生長的機(jī)制。然而，腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境相互作用的體外模型匱乏，類器官培養(yǎng)的出現(xiàn)為理解癌癥中的腫瘤微環(huán)境開辟了新的途徑。
類器官模型的局限性

1.再現(xiàn)性

目前類器官培養(yǎng)無法控制細(xì)胞如何自組織生成類器官，如類器官的大小、形狀、細(xì)胞組成、表型和分子特征等。盡管最近在標(biāo)準(zhǔn)化和更好地控制衍生類器官（如皮質(zhì)類器官）方面取得了進(jìn)展，但臨床和制藥方向需要生產(chǎn)完全一致的類器官以實(shí)現(xiàn)質(zhì)量控制和安全性，當(dāng)前的培養(yǎng)技術(shù)還無法完全做到^[5]。

2.血管生成

氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)通過血管運(yùn)輸給類器官，從而促進(jìn)細(xì)胞更好地發(fā)育成組織樣結(jié)構(gòu)，使類器官中的細(xì)胞能夠像外周細(xì)胞一樣存活和發(fā)揮作用。但是促進(jìn)類器官中血管生成并非易事，研究腫瘤發(fā)生和血管生成的血管化3D癌癥模型、生物打印的3D血管化組織模型等已被開發(fā)，但該技術(shù)仍不成熟，無法在類器官中生成大量血管網(wǎng)絡(luò)。

3.血液灌注和炎癥

現(xiàn)有的3D類器官疾病模型仍無法捕獲體內(nèi)發(fā)生的復(fù)雜和動(dòng)態(tài)炎癥生態(tài)位。血液作為免疫細(xì)胞的載體培養(yǎng)基，對人體的炎癥反應(yīng)至關(guān)重要。免疫細(xì)胞通過化學(xué)吸引到達(dá)損傷部位，在細(xì)胞粘附分子作用下與血管壁相互作用，然后外滲到發(fā)炎部位。因此在3D體外模型中模擬炎癥，需要先生成血管進(jìn)行血液灌注。成功建立炎癥生態(tài)位的3D模型對于研究動(dòng)脈粥樣硬化性血管疾病、炎癥性皮膚病、間質(zhì)性腎炎甚至炎癥性腸病具有重要意義。

4.類器官模型驗(yàn)證          

在類器官技術(shù)出現(xiàn)之前，小鼠模型常常用于疾病建模中。人源化小鼠是嚙齒動(dòng)物，獲得方法是將其先天免疫系統(tǒng)移除并通過人造血干細(xì)胞移植完全重新填充了人類免疫細(xì)胞。這種人源化小鼠模型對于疾病病理學(xué)建模特別有用，并允許在與人類生理學(xué)相關(guān)的體內(nèi)環(huán)境中評估潛在的治療候選藥物，由于存在完整的免疫系統(tǒng)和血液循環(huán)，它們?yōu)槿�面研究疾病病理學(xué)提供了一個(gè)系統(tǒng)的環(huán)境。許多研究已經(jīng)成功地使用人源化嚙齒動(dòng)物來模擬人類疾病為疾病發(fā)病機(jī)制和免疫學(xué)-疾病相互作用組提供了新的見解，但是，研究人員已經(jīng)開始意識到并報(bào)道嚙齒動(dòng)物和人類免疫學(xué)之間的明顯差異，從而對使用小鼠模型研究人類疾病的相關(guān)性提出了質(zhì)疑。而在3D類器官中對人類疾病的建模可能仍然需要最終使用人源化小鼠模型進(jìn)行體內(nèi)驗(yàn)證。

5.數(shù)據(jù)獲得

類器官培養(yǎng)成本高昂且耗時(shí)，在生成和維持、遺傳穩(wěn)定性和臨床應(yīng)用方面的效率各不相同。在數(shù)據(jù)獲得過程中，人工在顯微鏡下拍攝類器官圖像，耗時(shí)耗力；頻繁拍攝圖像過程中會(huì)影響類器官培養(yǎng)環(huán)境；孔板內(nèi)各孔的類器官培養(yǎng)情況無法全面呈現(xiàn)；使用顯微鏡觀察類器官獲得的數(shù)據(jù)分析有限。

JuLI™ Stage活細(xì)胞成像分析系統(tǒng)在類器官中的應(yīng)用


圖2.類器官實(shí)驗(yàn)流程圖

神經(jīng)類器官為研究神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)疾病建模、篩選藥物和開發(fā)基于細(xì)胞的治療方法提供了一個(gè)強(qiáng)有力的工具。我們挑選了一篇使用JuLI™ Stage活細(xì)胞成像分析系統(tǒng)應(yīng)用在類器官疾病模型方向的代表性文章，來自中山眼科中心的研究團(tuán)隊(duì)在《Science Advances》期刊發(fā)表一篇名為“Generation of self-organized sensory ganglion organoids and retinal ganglion cells from fibroblasts”的文章^[6]。
為研究ABI重編程的神經(jīng)元是如何組織形成神經(jīng)節(jié)類器官（iSG）的，研究人員將來自CAG-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠的胚胎成纖維細(xì)胞（MEFs）與ABI慢病毒在12孔板中共孵育10天后，使用JuLI™ Stage活細(xì)胞成像分析系統(tǒng)進(jìn)行延時(shí)拍攝，共記錄50h，顯示由ABI誘導(dǎo)的單個(gè)神經(jīng)元自組織成一個(gè)iSG全過程。與MEF相比，重編程的單個(gè)神經(jīng)元看起來更圓、更有神經(jīng)元特征，并顯示出更高的對比度和更亮的GFP熒光。在拍攝記錄的50小時(shí)中，神經(jīng)元首先通過遷移形成更小的細(xì)胞簇，然后合并成類似感覺神經(jīng)節(jié)（SG）的細(xì)胞簇。


圖3. ABI誘導(dǎo)的單個(gè)神經(jīng)元自組織形成iSG過程

iSG神經(jīng)元表現(xiàn)出成熟感覺神經(jīng)元的生理特征。疼痛感覺神經(jīng)元表達(dá)離子通道Trpv1、Trpm8和Trpa1分別對熱、冷和有害的化學(xué)物質(zhì)作出反應(yīng)。研究者通過鈣成像，使用10μM Capsaicin或100μM Menthol來刺激 Trpv1 和 Trpm8，以證實(shí)這兩種通道在 iSG 神經(jīng)元中的功能表達(dá)；通過瞬時(shí)灌注100 mM的KCL來監(jiān)測細(xì)胞的功能活力。使用JuLI™ Stage活細(xì)胞成像分析系統(tǒng)進(jìn)行延時(shí)拍攝，記錄樣本變化過程。結(jié)果表明在使用鈣指示劑Fluo-8 AM孵育后，幾乎所有由ABI誘導(dǎo)的iSG團(tuán)簇均顯示出綠色熒光（圖2，L至N）。在所有記錄的細(xì)胞中，56.8%的細(xì)胞對Capsaicin有反應(yīng)，70.4%的細(xì)胞對Menthol有反應(yīng)（圖3，O到U），表明大量iSG神經(jīng)元表達(dá)了具有疼痛感覺神經(jīng)元特征的離子通道。  



圖4. (L至N)與Fluo-8 AM孵育后，ABI誘導(dǎo)的iSG和相應(yīng)的熒光信號結(jié)果圖，比例尺：20μm。（O至Q）在Ringe(O)、10μM Capsaicin(P)和100 mM KCl(Q)中，熒光強(qiáng)度顯示的鈣離子變化。比例尺，20μm。(R)對10μM Menthol和100 mM KCl的代表性鈣反應(yīng)。鈣反應(yīng)計(jì)算為熒光（∆F）比初始基線熒光（F0）的變化。(S)對10μM Capsaicin和100 mM KCl的代表性鈣反應(yīng)。（T和U）散點(diǎn)圖顯示了單個(gè)細(xì)胞對Menthol、Capsaicin或KCl的積極反應(yīng)。


類器官在藥物篩選、疾病建模、再生醫(yī)療等方向具有巨大的潛力，在過去十年類器官技術(shù)取得了巨大的進(jìn)展，并擴(kuò)展成更復(fù)雜的人類疾病模型。盡管存在著許多挑戰(zhàn)與局限性，已有的類器官培養(yǎng)方法和實(shí)驗(yàn)程序幫助我們更好地開發(fā)類器官研究系統(tǒng)，提供對人類疾病所涉及的分子機(jī)制的全面和可靠的理解。使用JuLI Stage活細(xì)胞成像分析系統(tǒng)，適應(yīng)各種實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)和類器官細(xì)胞，適配從類器官圖像采集到數(shù)據(jù)分析的完整流程，極大地節(jié)省人工、時(shí)間，提高實(shí)驗(yàn)效率，得到豐富的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

參考文獻(xiàn)：
[1]Ho BX, Pek NMQ, Soh BS. Disease Modeling Using 3D Organoids Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells. Int J Mol Sci. 2018 Mar 21;19(4):936. （IF 5.6）
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[3]Weeber F, Ooft SN, Dijkstra KK, Voest EE. Tumor Organoids as a Pre-clinical Cancer Model for Drug Discovery. Cell Chem Biol. 2017 Sep 21;24(9):1092-1100. (IF 8.6)
[4]Guan Y, Xu D, Garfin PM, Ehmer U, Hurwitz M, Enns G, Michie S, Wu M, Zheng M, Nishimura T, Sage J, Peltz G. Human hepatic organoids for the analysis of human genetic diseases. JCI Insight. 2023 Oct 23;8(20):e176034. （IF 8.0）
[5]Huch M, Knoblich JA, Lutolf MP, Martinez-Arias A. The hope and the hype of organoid research. Development. 2017 Mar 15;144(6):938-941. (IF 4.6)
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