貼壁細胞培養(yǎng)實驗步驟

貼壁細胞培養(yǎng)攻略
 

一，貼壁細胞的分類及形態(tài)

貼壁細胞一般分為皮細胞型，成纖維細胞型，游走細胞型和多型細胞型。

在顯微鏡下觀察時，貼壁細胞在瓶底伸展并延伸成梭型或不規(guī)則的三角形或扇形或其它形態(tài)，而且晃動培養(yǎng)液時，細胞不動。培養(yǎng)細胞在未貼附于底物之前一般均似球體樣；當與底物貼附后，細胞將逐漸伸展而形成一定的形態(tài)，呈成纖維細胞樣或上皮細胞樣等。

二，實驗材料與儀器

實驗材料：細胞、PBS 或 DPBS、0.25% (w/v) Trypsin-EDTA、75% 乙醇、培養(yǎng)基、100X 雙抗（鏈霉素-青霉素）、胎牛血清、細胞凍存液。

實驗儀器及耗材：培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶、移液槍、離心管、記號筆、封口膜、凍存管、程序降溫凍存盒、液氮罐、離心機、37℃ 恒溫培養(yǎng)箱（5% 二氧化碳濃度）、倒置相差顯微鏡、冰箱、無菌細胞操作臺。

三，實驗步驟

1. 試劑準備

DMEM完全培養(yǎng)基（10% 胎牛血清）：44.5 mL DMEM +5 mL 胎牛血清+500 μL 100X 雙抗，搖勻，4 ℃ 冷藏保存，使用前于 37 ℃ 恒溫水浴鍋中預熱 15 分鐘。

PBS、完全培養(yǎng)基、根據細胞特性選擇合適的解離液或機械吹打消化細胞、胰蛋白酶解離劑 0.25% (w/v) Trypsin-EDTA于 4℃ 冷藏保存，使用前于 37 ℃ 恒溫水浴中鍋預熱 15 分鐘。

2. 細胞復蘇

1) 超凈工作臺使用前紫外線照射 30 分鐘。使用前，后用 75% 酒精擦拭臺面。保持臺面干凈整潔。使用時一定打開通風。

2) 將凍存細胞從 -80 度冰箱或液氮罐中取出，立即放入（2 分鐘內）37 ℃ 恒溫水浴中預熱水浴鍋中（或在手心中反復摩擦），不停晃動以化凍。

3) 立刻將化凍的細胞液轉移進裝有 3 mL DMEM完全培養(yǎng)基的 5 mL離心管中并吸打均勻。注意液體不要留在瓶口或瓶蓋上，避免增加污染的可能。

4) 復蘇細胞時，離心機提前降溫至 4℃，以 1000 rpm 的轉速將細胞懸液離心 5 分鐘并棄上清。

5) 用 3 mL DMEM 完全培養(yǎng)基重懸細胞，并轉移進 6 cm 細胞培養(yǎng)皿中，放入細胞培養(yǎng)箱中。

6) 在顯微鏡下觀察復蘇細胞的狀態(tài)，并及時更換DMEM完全培養(yǎng)基。

7) 當細胞密度占顯微鏡視野 80%～90% 時，應進行細胞傳代。

3. 貼壁細胞傳代（以 6 cm 細胞培養(yǎng)皿為例）

1) 棄置原培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，從培養(yǎng)皿邊緣加入 2 mL 預熱的 PBS 平衡鹽溶液潤洗細胞（注意不要直接沖到細胞表面）。

2) 沿培養(yǎng)基側壁加入1 mL 預熱的 0.25% (w/v) Trypsin-EDTA，使胰蛋白酶完全覆蓋細胞表面。于細胞培養(yǎng)箱中孵育，孵育時間根據細胞的特點而定。

3) 向培養(yǎng)皿中加入1 mL 完全培養(yǎng)基中和 Trypsin 的作用，并輕輕吸打細胞表層數(shù)次。將細胞懸液轉移到 5 mL 離心管中，在室溫下以 1000 rpm 的轉速將細胞懸液離心 3 分鐘。

4) 小心棄去離心管中的上清液，使用 1mL 完全培養(yǎng)基輕輕重懸細胞沉淀，使其完全被吹打為單個細胞狀態(tài)，盡量減少泡沫的產生。

5) 進行細胞計數(shù)后以 1:3（1:3～1:6均可）的比例進行細胞傳代。

6) 取三只新 6 cm 細胞培養(yǎng)皿，每只培養(yǎng)皿中加入 3 mL 完全培養(yǎng)基，將細胞懸液平均分配至三只培養(yǎng)皿中，蓋上蓋子后，按照畫十字的操作，將細胞搖勻。

7) 細胞培養(yǎng)皿放入細胞培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察細胞狀態(tài)并及時更換培養(yǎng)液。
 

逐典TrypLUS消化液是一種胰蛋白酶類似物（Trypsin Like Enzyme），是一種通過生物工程制備的非動物源性重組蛋白酶，與胰蛋白酶有相似的解離動力學，穩(wěn)定性更高，純度更好，消化更溫和，細胞毒性更低。目前主要應用于細胞培養(yǎng)中，可以在賴氨酸和精氨酸的C末端切割肽鍵，可以替代豬或牛胰蛋白酶（Trypsin）對貼壁細胞的消化解離。生物制藥中，GMP級別的TrypLUS能夠為疫苗生產、病毒載體生產提供高質量和高性價比的貼壁細胞消化解決方案。