光合氣體交換測量指南

本綜述文章概述了光合作用氣體交換測量的基本原理，并就如何獲取測量數據和正確解釋數據提供最佳實踐指南。它旨在為新手提供氣體交換技術方面的堅實基礎，同時也為有經驗的研究人員提供參考。
 

通過光合作用氣體交換測量，可以從機理上深入了解植物葉片中碳和水通量的基本過程，進而了解從單個細胞到整個生態(tài)系統(tǒng)等不同尺度的相關過程。鑒于光合作用對全球氣候討論的重要性，學界普遍認為以下兩點需要提升：1.廣大研究人員應對所使用實驗方法的基本原理有最基本的了解；2. 明確相關研究的最佳實踐指南和正確的數據解釋。2024年2月6日，Plant, Cell & Environment雜志刊發(fā)了英國伯明翰大學等多家單位署名的綜述文章，標題為A guide to photosynthetic gas exchange measurements: Fundamental principles, best practice and potential pitfalls。在該綜述中，Florian A. Busch等人概述了可通過氣體交換測量方法研究的光合作用生物化學和生物物理參數，并就如何可靠地測量這些參數提供了逐步指導。此外，文章還提供了使用氣體交換設備的最佳實踐建議，并強調了實驗設計和數據解讀中可能存在的誤區(qū)。補充信息包含示例數據集、實驗方案和數據建模流程。這篇綜述是一項團隊協作的成果，旨在讓實驗研究人員和數據建模人員扎實了解氣體交換測量的理論基礎、不同實驗方案背后的原理以及數據解讀方法。

幾十年來，使用紅外氣體分析儀(IRGAs)的氣體交換技術已被廣泛用于測量進出葉片的CO₂和H₂O通量，非葉片組織的通量測量則較少使用。通過這些測量可以評估葉片的生理活性，并確定光合作用的生化能力。對葉片水平氣體交換的測量有助于從機理上理解決定碳和水通量的分子過程，并為理解生態(tài)系統(tǒng)功能提供信息。目前的商用氣體交換系統(tǒng)在腔室設計和分析器設置方面的技術創(chuàng)新由來已久，這些系統(tǒng)精確、便攜，而且相對易于使用。從熱帶到北極，從草原到森林再到農田，這些系統(tǒng)廣泛應用在不同的生態(tài)系統(tǒng)中原位測量光合作用二氧化碳同化(A)和氣孔導度(g_s)。

氣體交換測量可檢驗葉片和大氣之間的CO₂和H₂O通量如何隨著葉室內環(huán)境條件的變化而變化，以及不同環(huán)境條件下的長期生長如何影響光合作用的速率、生化能力和擴散限制。氣體交換測量還增進了人們對進行不同類型光合作用物種(如 C3、C4和CAM)的生理學了解。

學界之前曾出版過幾本氣體交換入門指南，大多側重于特定測量技術的細節(jié)。在下文中，Florian A. Busch等人將概述可通過氣體交換測量來研究的生物化學和生物物理相關的光合作用過程，并概述可估算的參數。然后，文章還將討論在C3植物中利用光合氣體交換技術量化這些參數的合適方法，C3植物是光合作用的主要途徑。不過，在許多情況下，這些方法經適當修改后也可應用于C4或CAM光合作用的物種，本文同樣會涉及一些。

雖然使用目前市售設備記錄氣體交換數據相對容易，但獲得的數據并不一定有意義。正確的實驗設計和數據解釋對于獲得高質量的信息至關重要。因此，Florian A. Busch等人在本綜述中提供了以往指南中沒有的 "操作方法"提示。當然，商用氣體交換設備的具體設計因制造商而異，讀者應參考制造商的操作手冊。我們的建議和術語基于當前的通用做法，但在我們認為新方法有益的地方會有所偏離。其中尤其包括對光響應曲線擬合的新建議。因此，這篇綜述將為新手打下堅實的技術基礎，同時也為經驗豐富的研究人員提供一些新思路。總之，作者的目的是概述有助于成功測量的步驟，但同時也注意到，這些建議可以而且可能必須針對具體的研究問題進行修改。

從氣體交換測量獲得的關鍵參數
光合作用的CO₂固定是一系列復雜生物化學和生物物理過程的結果，其中許多過程都可以通過氣體交換技術進行測量。氣體交換測量可讓我們了解碳和水關系的各個方面，從與依賴光和不依賴光反應相關的過程到CO₂/H₂O擴散和葉片的吸收匯能力。氣體交換測量直接提供給我們的唯一信息是CO₂和H₂O的濃度以及相關的凈通量。不過，根據某些假設，可以從這些數值間接估算出一系列參數。這些參數可粗略地分為三類(圖1，表1)：第一類說明了葉片的"最大"能力，該類型的參數描述了葉片在不同光合作用方面投入的內在特性。這些參數可能對溫度有固定的反應，也可能在葉片的整個生長過程中發(fā)生變化，但在其他情況下可被視為常數。第二類是葉片當前的生理狀態(tài)，即測量期間實現的 "瞬時"或 "有效"速率。這些變量會隨著光照強度、大氣[CO₂]或水分狀況等環(huán)境條件的變化而在短期內(幾秒到幾小時)發(fā)生變化。第三類包括描述光合作用性能在某些特定方面的參數，這類參數可能并不直接對應某個單一可識別生理性狀。例如，A從一種生化限制過渡到另一種限制時的CO₂濃度，或限制A 的不同生理過程的相對貢獻。
 

圖1. 如何為自己的研究問題選擇正確的測量參數。光合特性可分為描述生化和氣體擴散特性的性狀以及進入或流出葉片的氣體通量。因此，第一步是確定氣體交換測量要評估的性狀大類。然后是所關注的光合特性是與葉片的固有特性有關，還是與葉片在特定環(huán)境條件下的運行狀態(tài)有關。其他更具描述性的特性也可以通過氣體交換測量來估算。為支持研究問題，文章給出了可以量化的參數，以及適用每種參數的實驗方法，詳細說明見補充資料 S1。參數和變量的定義見表 1。
 

表1 環(huán)境條件下的光合氣體交換參數、單位和典型值
 

最大氣體交換能力、通量和導度
光合作用生理生化過程的最大氣體交換能力由三個變量決定：1. 1,5-二磷酸核酮糖(RuBP)羧化的最大速率(V_cmax)代表卡爾文-本森-巴塞爾循環(huán)(CBB)中 RuBP 的消耗能力，其中核酮糖-二磷酸羧化酶-加氧酶(Rubisco) 被認為是關鍵的限速步驟。2. 光合電子傳遞的最大速率(J_cmax)代表參與 RuBP 再生的所有過程，它被認為受到光系統(tǒng) II(PSII)的水分分解速率和/或通過細胞色素 b6f 的電子傳遞速率的限制。V_cmax和 J_cmax是葉綠體二氧化碳濃度(或J_cmax的光照強度)為無限時理論上可以達到的速率，除 Rubisco羧化(或電子傳輸)外，沒有其他過程受到限制。3. 磷酸三糖的最大利用率T_pmax與葉綠體合成淀粉或輸出蔗糖的能力有關。T_pmax可能反映了其他植物器官代謝或儲存新同化物的限制，因此是描述植物整體吸收能力的 CBB 循環(huán)的下游。這三個參數是模擬 A 對環(huán)境條件反應的核心。

一組參數描述了特定環(huán)境條件下凈CO₂或H₂O交換的最大速率。例如，A_max描述的是當光照和[CO₂]達到飽和，Rubisco 加氧受到很大抑制時的最大CO₂同化速率。A_sat是環(huán)境CO₂濃度和光飽和條件下的凈CO₂同化率，因此是自然環(huán)境光照波動條件下可達到的最大同化能力的良好指標。在一定溫度范圍內的最大CO₂凈同化率稱為 A_opt。該參數有助于從功能上描述凈光合作用對溫度的響應。

在CO₂同化通量進入葉片的同時，CO₂還通過線粒體、葉綠體和細胞質中的脫羧過程從呼吸和光呼吸中釋放出來。為簡單起見，并與傳統(tǒng)術語一致，這里將非光呼吸的CO₂釋放總和稱為"線粒體"呼吸。黑暗中的呼吸速率(R_dark)在晝夜間有些變化，但總體而言是葉片線粒體活動的良好指標。R_dark是衡量植物在24小時晝夜過程中總體碳吸收量的一個重要參數，因為呼吸作用在整個夜間持續(xù)進行，抵消了白天的碳增量。由于碳吸收量是光合作用的CO₂吸收量和呼吸作用的CO₂釋放量的組合，要模擬白天的碳吸收量對環(huán)境條件的響應，就必須了解光照下的呼吸作用(R_light)。一些證據表明，呼吸作用在光照下會受到部分抑制，這突出表明需要對R_light進行單獨測量，以確定光合作用模型的參數。也有觀點認為，R_dark和R_light之間的差異可能在很大程度上是由于光照強度變化時葉綠體CO₂濃度(C_c)發(fā)生了不可解釋的變化，這意味著對 R_dark的測量可能足以對模型進行參數化：R_dark和R_light通常指的是流出葉片的呼吸通量，而光合作用模型通�；诩毎麅人降暮粑�(表示為R_d)。它們的區(qū)別在于流出葉片前被再固定的CO₂量，據估計，從線粒體到細胞間隙的過程中，再固定的CO₂量約為 24%-38%。如果假定光照不會抑制呼吸作用，則可將R_d設為R_dark。值得注意的是，作為葉片層面的屬性，呼吸作用與CO₂同化的符號相同，是一種 "正 "通量，盡管方向相反。
 

瞬時速率或有效速率和導度
描述特定環(huán)境條件下光合作用有效特性的最重要變量是瞬時CO₂凈同化速率(A；通常也稱作A_net)和蒸騰速率(E)，這可以通過氣體交換直接測量(見Box1)。根據這些變量，我們可以估算出植物在當前條件下的瞬時水分利用效率(WUE)，即A與E之比。然而，E不僅取決于植物的生理狀態(tài)和氣孔的開放程度，還受到葉片內部與周圍空氣之間的蒸汽壓差(VPD_leaf)的很大影響。因此，E本身并不能告訴我們植物的內在狀態(tài)，也不能告訴我們 WUE如何隨著環(huán)境條件的變化而變化。因此，內在水分利用效率(iWUE)是對H₂O損失和CO₂吸收之間權衡的一種更生理學的描述，它表示為A與氣孔對水蒸氣的導度(阻力的倒數)之比(g_sw)。

除了生化參數的最大能力外，我們還可以從氣體交換中獲得在特定環(huán)境條件下實現的相應值。實際光合電子傳遞速率(J_a)與依賴光的光合反應的當前狀態(tài)有關，既反映了可用于驅動電子傳遞的光能，也反映了當前利用CBB循環(huán)中產生的NADPH和ATP的能力。與光無關的光合反應活性由Rubisco當前的羧化速率(V_c)和氧合作用速率(V_o)表示。根據這兩個參數，我們可以推斷出通過 CBB 循環(huán)和光呼吸途徑的通量。最后，我們還可以量化任何特定環(huán)境條件下磷酸三糖的有效利用率(T_p)。這四個參數都不是通過氣體交換直接測量的，而是借助下文所述的光合作用生化模型從A和E中推導出來的。
 

描述光合作用性能的其他特性
氣體交換測量還可提供具有描述性的其他參數，有助于植物或處理之間的比較。這些參數包括A達到光飽和(I_sat)時的入射光強度(I_inc；通常也稱為Q)、光補償點(I_c)和CO₂補償點(Γ)，它們描述了光合作用和呼吸作用達到平衡(A=0)時的光強度或CO₂濃度，以及光合作用達到最佳(T_opt)時的葉片溫度(T_leaf)。我們甚至可以通過限制分析得出參數，回答 "如果 "問題，限制分析的目的是量化由于氣孔或生化限制而放棄的CO₂吸收量。例如，相對氣孔限制(l_s)探究了氣孔干擾CO₂擴散導致A值減少的程度，或者相對生化限制(l_b)量化了 Rubisco未完全激活對A值的相對影響。

上述一長串參數雖然并不全面，但卻體現了可以從光合氣體交換測量中提取的信息的多樣性。它們提供了有關植物生理狀態(tài)的重要信息，并可隨著植物的老化和發(fā)育或對環(huán)境因素的反應而進行跟蹤。要量化每個參數，都需要遵循一定的測量策略。雖然可以通過相對簡單的調查測量來研究瞬時光合通量、呼吸通量和透氣通量，但確定光合氣體交換能力和限制的參數和性狀需要對A對環(huán)境參數(如[CO₂]、光照或溫度)的反應進行更復雜的測量。下面我們將介紹哪些測量方法最適合獲得所選參數，以及如何控制IRGA以獲得可靠的數值。
 

與氣體交換測量相關的 3 個光合作用生理原理
測量和解釋光合作用氣體交換具有挑戰(zhàn)性，主要有兩個原因。首先，在測量過程中，光合作用對光照、溫度、濕度和空氣中的氣體成分反應強烈，這意味著在測量光合作用本身的同時，需要嚴格控制和測量這些因素。其次，雖然氣體交換測量通常確定的是凈氣體交換量，但觀測結果通常反映的是幾種綜合過程的總通量。例如，CO₂凈交換量包括 CBB 循環(huán)中與RuBP羧化相關的CO₂吸收通量，以及呼吸作用和光呼吸過程中釋放的CO₂。在一系列不同條件下進行的測量使我們能夠將這些凈通量分解為其總成分，這將在隨后的章節(jié)中進一步解釋。

光合氣體交換的決定因素可分為擴散限制和生化限制。CO₂要被C3植物固定，首先必須穿過葉片周圍靜止空氣的邊界層，然后通過氣孔穿過表皮層，到達葉片的細胞間氣體空間(IAS)。在到達CO₂固定地點之前，還需要經過細胞壁、質膜、細胞質、葉綠體包膜和部分基質等一系列擴散障礙(見圖 2)。從周圍空氣(C_a)到 IAS(C_i)，再從 IAS 到葉綠體基質(C_c)的CO₂濃度梯度推動了這一擴散途徑中的CO₂凈轉移。這些梯度是由葉綠體基質通過 CBB 循環(huán)及其中心酶Rubisco的活性吸收CO₂形成的，而CBB循環(huán)及其中心酶Rubisco的活性又依賴于葉綠體類囊體膜上光化反應產生的ATP和還原劑NADPH。

圖2. 葉片內H₂O和CO₂擴散示意圖。如果已知邊界層對H₂O擴散的導度(g_bw)，那么通過氣孔排出葉片飽和細胞間氣體空間(IAS)(w_i)中的水蒸氣可用于通過測量大氣中的水蒸氣濃度(w_a)來量化氣孔對H₂O擴散的導度(g_sw)。在氣體交換測量過程中，使用高速風扇的氣體交換室會將邊界層降至最低，因此可以使用經驗值對其進行合理的計算。由此，我們可以描述CO₂反向擴散到IAS的路徑，還需要額外的信息來描述向葉綠體(C)擴散的路徑。通過邊界層(g_bc)、氣孔(g_sc)和葉肉(g_m)進行CO₂擴散的有限傳導可被視為擴散阻力，它導致大氣中的CO₂濃度(C_a)逐漸下降到細胞間隙中的CO₂濃度(C_i)和葉綠體中的CO₂濃度(C_c)。C_c和葉綠體中的氧氣濃度決定了Rubisco羧化(V_c)和加氧(V_o)的相對速率。在加氧反應之后，光呼吸CO₂從線粒體(M)中釋放出來，其中還涉及過氧物酶體(P)中的一些反應。

要分析光合作用的生化限制，首先需要確定CO₂轉移的擴散軌跡參數。在這方面，需要同時測量水蒸氣交換。與進入葉片的CO₂凈轉移類似，葉片外的水分轉移也是由擴散決定的。從水蒸氣可被假定為飽和(或在中低VPD條件下接近飽和)的IAS開始，水蒸氣沿著蒸汽壓力梯度向葉片周圍較干燥的空氣擴散。在大多數情況下，蒸騰作用造成的水分損失主要與通過氣孔的擴散轉移有關，不過觀測到的水分釋放率也可能包括通過角質層從葉片中流出的水分(見Box2)。
 

光合作用機理模型
除A、R_d和E外，大多數光合作用氣體交換參數都無法直接測量，而是借助生化模型，根據A對環(huán)境參數(如CO₂濃度或光照強度)變化的反應推導得出。對于C3光合作用，通常采用Farquhar等人1980 年提出的模型(以下簡稱 FvCB)，von Caemmerer在2000年對該模型進行了更詳細的描述。我們對FvCB模型進行了簡明扼要的概括，并采用了一些對參數估計有用的修改(見Box3)。在其基本形式中，FvCB模型側重于光合作用吸收CO₂的主要原理，并將CBB循環(huán)反應的全部內容濃縮為Rubisco的活動等。不過，該模型可以進行調整，以解決新問題和參數估計的需要。本文討論的許多光合作用參數可以通過將機理模型與不同環(huán)境條件下獲得的實驗數據(如CO₂濃度或光照強度)進行擬合來量化。
 

反過來，在已知光合作用參數的情況下，FvCB模型可以預測多種環(huán)境條件下的CO₂同化。因此，FvCB模型已被廣泛集成到冠層、生態(tài)系統(tǒng)和全球碳通量模型中。由于光合氣體交換參數在地球系統(tǒng)模型中的核心地位，人們在描述模型參數的遺傳、發(fā)育和環(huán)境變異方面做出了巨大努力。
 

適合估算單個光合作用參數的 5 種測量類型
在前面的章節(jié)中，我們討論了可從氣體交換測量中得出的主要光合作用參數，以及這些參數與我們對光合作用功能的理解之間的關系。補充資料S1中概述了一系列"如何"可靠估算這些光合作用參數的實驗程序。其中包括調查測量、A/C_i響應、A/I_inc 響應、A/T響應、Laisk和Kok測量的程序，以及其他較少應用的光合作用測量的簡要說明。對于補充資料S1中的建議，我們總結了整體來說我們認為的 "最佳實踐"。不過，有必要重申的是，不同的問題需要不同的測量方法，而且每個實驗裝置在設備和可用時間方面都有不同的限制，因此必須做出折衷。因此，我們的建議應被視為設計個性化方法的起點。

估算光合作用參數的模型擬合程序
通過非線性曲線擬合程序，可從CO₂響應曲線(即V_cmax、J和T_pmax)和光響應曲線 (J_max)估算光合作用能力參數，以最大限度地減小收集的CO₂同化數據(A)與根據 FvCB 方程(公式18)模擬的基本預測A之間的差異。常用的數據分析工具包括基于Excel電子表格的光合響應曲線擬合方法、用于獲得類似非線性擬合輸出的R軟件包(如plantecophys、plantecowrap、photosynthesis和msuRACiFit)，甚至還有返回擬合數據的在線服務(如 leafweb.org)。盡管無論使用哪種工具，標準的A/C_i曲線擬合程序都基于相同的理論，但由于方法的特定固有假設和缺點，參數估計會出現差異。例如，基于電子表格的擬合工具對許多熟悉Excel求解器插件的生理學家來說都是可用的，但要求用戶對限制因素做出判斷，并指定從RuBP飽和到RuBP限制A的過渡，以分別求解V_cmax和J。因此，使用這種方法進行估算需要依靠用戶經驗做出主觀判斷，而且必須對每條曲線進行獨立分析。雖然這種方法可以深入了解支持每項測量的數據，但卻阻礙了大規(guī)模分析。廣泛使用的 plantecophys R軟件包通過在收集到的整個二氧化碳范圍內將數據擬合為A_c、A_j和A_p的雙曲線最小值，從而避免了靠經驗指定數據限制的需要，不過過渡點可以固定，以便根據假設檢查擬合結果。采用基于編碼而非電子表格的曲線擬合程序的一大優(yōu)勢是減少了每條曲線的分析時間，提高了通量、可重復性和可共享性，但這取決于用戶對編程語言的適應程度。下一代R軟件包正在出現，包括光合作用軟件包，其中不僅包含擬合A/C_i曲線的功能，還包含擬合A/I_inc曲線、R_light、葉肉和氣孔導度以及水力曲線的功能。在這一點上需要注意：不同統(tǒng)計軟件包之間的參數符號可能并不統(tǒng)一，可能與本文不同。同樣，用于擬合數據的函數也存在差異，尤其是用于擬合A/I_inc反應的函數。

FvCB模型的準確性取決于對Rubisco動力特性的正確表述，并需要對Rubisco Michaelis–Menten常數(K_c、K_o或空氣中的有效值K_m)和Γ*及其溫度依賴性(公式 22和23)進行估算�，F在已經從體外測量中獲得了這些參數的許多特定物種估計值，并顯示出物種間的巨大差異。然而，使用Rubisco動力溫度響應的體外估算值可能會產生A的模型值，隨著溫度向冷暖極端移動，這些值會偏離觀察到的測量值。使用這些溫度函數需要假設體內條件，如pH值和二氧化碳向羧化部位的擴散，體外測定條件的差異可能會使這一假設變得更加復雜。但另一方面，體外獲得的動力學參數不需要知道C_c或每次 Rubisco 加氧反應釋放的CO₂量(λ)，這可能是最重要的誤差來源。光合作用對氧氣或二氧化碳濃度變化的敏感性可獨立確定光合作用的基本限制。

影響二氧化碳響應曲線估計值的另一個參數是葉肉導度(g_m)，它影響葉綠體內二氧化碳的有效分壓，因此會影響擬合的V_cmax。低g_m會降低A/C_i曲線的曲率，如果有獨立的測量值，電子表格和基于編碼的曲線擬合工具都可以將其考慮在內。如果沒有獨立的測量值，則可通過在等式 22 和 23 中用(C_i - A/g_m)代替C_c，并使用非線性曲線擬合來估算g_m，以盡量減少與觀測數據之間的差異。獨立的g_m測量值可通過穩(wěn)定碳同位素技術、氣體交換與葉綠素熒光測量相結合或曲線擬合等方法獲得。曲線擬合法假定g_m恒定不變，而穩(wěn)定碳同位素技術可用于評估g_m在不同環(huán)境條件下的變化情況。

氣體交換（光合儀）的良好操作規(guī)范

測量前的基本檢查

在機器預熱期間，執(zhí)行制造商建議的測試。這可能包括檢查溫度參數和傳感器的準確性和響應性、照明控制和葉室氣體混勻風扇的功能。

定期標定和校準機器

由于老化(如紅外光強度降低)或由于吸收紅外線的顆粒(如灰塵)累積而衰減，紅外氣體分析儀的信號會隨時間漂移。除了定期對IRGA的CO₂和H₂O進行零點標定之外，在測量開始前或對IRGA進行維護(如清潔光學工作臺)時，根據低濃度和高濃度的參考氣體(截距和斜率)標定IRGA的跨度也是一個不錯的做法。對不同機器使用相同的標定氣體可提高測量精度并減少儀器間偏差。

檢查氣路是否漏氣

每次將葉片放入葉室夾緊后，都必須檢查氣路是否漏氣。多孔海綿墊圈會吸收/釋放 CO₂和H₂O，可能會導致葉室內外的微小通量。這些擴散通量的相對影響在二氧化碳響應曲線中使用的高[CO₂]和低[CO₂]條件下會加劇。如果外部CO₂已知，通�？梢詫ζ溥M行校正(參見制造商的文檔)。第二種漏氣是由于墊片與葉片形狀(尤其是主要葉脈)不完全吻合，導致墊片與葉片接觸面出現縫隙。要檢測這種漏氣，應在監(jiān)測室內[CO₂]的同時將呼出的空氣吹到腔室附近。如果室內的[CO₂]沒有出現尖峰，則表明沒有嚴重的漏氣。如果無法調整葉片在葉室內的位置以避免漏氣，可小心使用真空硅脂密封葉室。如果無法避免漏氣，則可采用幾種方法進行部分校正。

檢查密封墊片狀態(tài)

海綿墊片通常具有彈性，以適應葉片的形狀。然而，隨著使用時間的推移，它們可能會偏離原來的位置或老化變平，從而降低與葉片保持良好密封的效果。建議在不進行測量時或在儲存期間將葉室置于打開狀態(tài)，以延長密封墊片的壽命。

在測量過程中檢查穩(wěn)定性

在進行葉片氣體交換測量時，重要的是至少在短時間內(幾分鐘)進入葉室的空氣中的 [CO₂]和 [H₂O]保持穩(wěn)定。如果沒有使用機器的氣體混合器自動控制，則可以通過使用緩沖瓶來抑制環(huán)境氣流的快速波動并實現進入儀器的氣體濃度穩(wěn)定。

監(jiān)控系統(tǒng)參數

試驗室條件會在無意中迅速變化，例如，葉片溫度會隨光照強度迅速升高，這也會影響VPD_leaf。動態(tài)控制葉片溫度而不是保持葉室溫度恒定可以避免T_leaf的變化，但在光照強度變化后，由于進入的空氣溫度和水蒸氣的快速變化與葉室條件達到新的平衡，可能會在測量中產生瞬時距離波動(如氣孔導度的大幅飆升)。g_s和/或VPD_leaf的變化也會影響葉室內空氣的相對濕度(RH)，并有可能達到飽和狀態(tài)。因此，務必時刻監(jiān)測葉室內的露點溫度，以避免出現冷凝現象，尤其是在低流速和高葉片蒸騰量的情況下。在輸入控制此參數時對其進行查看也很重要，這樣可以在時間過長而需要重復測量之前發(fā)現氣孔閉合或CO₂鋼瓶耗盡等情況。

最大限度地提高信噪比

雖然葉室內氣體的高流速可加快測量響應速度，但同時也會降低參考和樣品IRGA之間測得的[CO₂]和[H₂O]差值。當濃度差值過小時，當IRGA的檢測極限大于所測得的差值時，光合作用和氣孔導度等計算數據就會變得嘈雜。減小通過葉室的氣流可以增大差值，有利于提高信噪比。然而，這同時也會增加潛在漏氣對測量的影響，因為空氣在葉室內的停留時間更長，腔體壓力更低，會加劇氣體通過墊片的擴散泄漏。流速越低，葉片蒸騰作用對濕度控制的影響就越大，因為水蒸氣會在葉室內積聚。建議從制造商推薦的流速值開始，然后根據葉片的反應進行調整。

調整光質組合比例

輻射光源通常由紅色和藍色波長的LED組合而成。長期以來，默認情況是高比例的紅光用于驅動光合作用(90%)，少量藍光用于刺激氣孔開放(10%)。由于葉片吸收率取決于波長，不同比例的紅光和藍光強度會導致不同的光合作用測量值。關于紅光和藍光重要性的傳統(tǒng)觀點受到了質疑，因為有些物種對藍光沒有反應，而其他波長的光，如綠光和遠紅光，可能在推動光合作用方面發(fā)揮重要作用。

匹配 IRGA

根據所使用的氣體交換系統(tǒng)，葉室內外的CO₂和H₂O可能由兩個不同的IRGA測量，如果它們的標定或響應稍有不同，就會產生系統(tǒng)偏差。為了解決這個問題，可將相同的空氣同時通過兩個IRGA，并通過電子方式將濃度讀數"匹配"為相同的值。通常在[CO₂]和/或[H₂O]發(fā)生變化或設定時間(如30分鐘)后對IRGA進行匹配。過于頻繁地進行匹配，尤其是當[CO₂]和/或[H₂O]發(fā)生瞬時變化時，可能無法獲得更準確的測量結果。通常最好等測量結果穩(wěn)定后再進行匹配(但這取決于系統(tǒng)，請查閱制造商手冊)。對于長期測量(如晝夜動力學)，必須定期進行匹配，因為IRGA隨時間的漂移可能會妨礙晝夜節(jié)律對光合作用影響的解釋。

選擇合適的葉室尺寸

理想情況下，氣體交換室的大小應與葉片尺寸成正比，因為當葉片覆蓋整個氣體交換室時，設置通常更容易操作。對于較小的葉室，由于空氣容量較小，反應時間較快，而較大的葉室則受葉片異質性(如氣孔斑塊)的影響較小，兩者之間需要權衡。氣孔斑塊是一種空間或時間異質性，可能由相鄰氣孔之間的水力相互作用引起，并影響細胞間CO₂濃度測量的準確性。因此，氣體交換葉室的大小應與實驗的要求和目的相匹配。

葉室氣流混勻風扇的轉速

葉室氣流混勻風扇可降低葉片周圍的邊界層。葉室氣流混勻風扇的高轉速可將邊界層降至最低，確保葉室內空氣充分混合，從而降低真實g_s值的不確定性。在使用定制葉室設置時，請使用大功率風扇以確保葉室空氣的良好混合。值得注意的是，對于給定的VPD_leaf，室內邊界層的減少意味著葉片比室外的葉片失水更多，如果有足夠的時間，這可能會影響g_s。因此，盡管環(huán)境條件可能相同，但葉室內外的葉片所處的"真實環(huán)境"并不相同，。

除了對邊界層的影響外，高風扇轉速還能促進空氣與葉片表面以及葉室壁體之間的熱交換。當測量溫度低于環(huán)境溫度時，低風扇轉速可能會成為一個問題，因為熱交換受阻會導致葉室內冷卻不足，進而產生冷凝問題。

保持葉室清潔

葉室內的灰塵和污垢會吸收和釋放氣體，從而干擾測量，尤其是當腔室內的條件快速變化時。當異物積聚在IRGA中時，會造成信號噪音并減弱信號強度。小動物(如蜘蛛、薊馬)會導致信號出現不穩(wěn)定的尖峰，因此在將葉片插入葉室內之前必須檢查葉片表面。盡量不要使用被害蟲破壞或受傷的葉片進行測量，因為它們會顯示出高蒸騰速率，而這并不是氣孔開度的結果。在田間測量時，確保將主機架離地面，以減少灰塵通過進氣口進入系統(tǒng)。

定期檢查化學藥品的性能

在開始一系列新的測量之前，必須使用新鮮的化學試劑(如堿石灰和硅膠/干燥劑)，以避免在測量過程中出現環(huán)境控制問題。大多數化學試劑都具有顏色指示功能，可以幫助判斷何時需要更換。在IRGA零點標定時，向進氣口吹氣有助于評估堿石灰的性能：在分析器CO₂零點標定的情況下，不應有CO₂通過氣路。

修正測量的葉面積

在某些情況下，室內的葉片不能完全覆蓋整個測量區(qū)域，因此需要手動確定并輸入一個值。葉面積可以通過葉片在腔體內的照片得出(如果是透明頂腔)，也可以用筆標出墊片的位置，然后拍攝照片。然后可以使用成像軟件(如開源圖像處理軟件包ImagJ)來估算面積。對于禾本科植物的葉片來說，測出葉片在葉室兩側的寬度通常就足以根據矩形形狀估算面積。由于光合通量以面積為基礎，因此要盡量避免葉片面積估算的誤差。

合理選擇要測量的葉片

大多數研究都使用最新完全展開的葉片進行測量。然而，在植物冠層內，由于光照梯度和葉齡的不同，光合作用能力存在很大差異。因此，在選擇測量植物的葉片時必須保持一致，并考慮時間因素，如長期實驗中的葉片老化。

應避免的 8 個"坑"

結露/冷凝

當葉室內空氣的露點溫度接近任何系統(tǒng)組件的最低溫度(通常是葉室壁體溫度)時，就會出現冷凝現象。盡管通常無法直接看到冷凝現象，但它仍會導致光合作用測量結果無效。一旦檢測到冷凝現象，就需要在進一步測量之前將機器烘干。為確保良好的濕度控制，測量前應確保干燥劑新鮮，IRGA正確歸零。在測量過程中，我們建議相對濕度不要超過85%。通過確�？諝饴饵c溫度始終比葉片、空氣或測量室溫度的最低值至少低一度來控制濕度，可防止測量室內形成高相對濕度和冷凝水。特別需要注意測量室壁的溫度，因為這是最有可能出現冷凝水的地方。在將葉片放入測量室后的幾分鐘內要特別注意，以確保在氣孔適應新條件時，蒸騰作用不會導致相對濕度過高。如果僅靠濕度控制無法維持設定濕度，需要降低濕度，則可提高葉室控制溫度和/或流速。

胞間CO₂濃度C_i負值

作為空氣中CO₂分子的摩爾分數，C_i值應始終為正值。如果葉室中出現冷凝現象，C_i值的計算就可能不正確，從而出現負值。在低[CO₂]時的CO₂響應曲線中，發(fā)生這種情況的風險尤其大，因為此時氣孔往往打開得最多。對于不能自動調節(jié)相對濕度以防止冷凝的機器，請遵循上述避免葉室內冷凝的建議。

漏氣

漏氣的主要原因通常是通過固定葉片在測量頭上的墊圈、未接牢固的排氣管、測量頭連接點上損壞的O形環(huán)以及干燥劑藥品管接頭密封不嚴造成的。流量無法達到設定點，CO₂值波動較大，無法達到高于空氣的CO₂控制值，都可能表明存在漏氣。如果懷疑有漏氣，請進行以下檢查(另請參見 "良好操作規(guī)范"部分)：

1.測量頭是否正確關閉，密封墊是否完好？如果老化導致密封不良，請更換密封墊片。

2.排氣管是否正確連接到測量頭和主機？

3.加濕劑和干燥劑管是否正確安裝就位，蓋子是否密封，空氣過濾器是否完好？

4.熱電偶是否安裝正確？

5.檢查所有O形環(huán)，更換損壞的O形環(huán)。

氣孔關閉

如果g_s過低，例如當植物處于干旱脅迫時，則很難獲得較高的C_i值和有用的A/C_i響應。對于這些測量，適當調整VPD_leaf非常重要，因為過度蒸騰是造成氣孔關閉的主要原因：一般來說，為避免氣孔關閉，VPD_leaf不應超過1.5千帕，同時需要確保相對濕度不超過 85%，以避免冷凝。適合大多數測量的VPD_leaf范圍約為0.8-1.2千帕。適當的VPD_leaf水平還取決于機器是否需要加熱或冷卻葉室以達到設定的測量溫度。在前一種情況下，相對濕度為85%可能比較合適，而在后一種情況下，高的相對濕度則會導致冷凝。保持植物水分充足，不要在測量前溫度/濕度驟變的情況下接觸植物，這很有幫助。如果盡管如此，氣孔反應仍然非常緩慢，請檢查光質設置(藍光的貢獻率至少應為10%，參見上文"調整光質")。也可將葉片短暫置于低[CO₂](約100 μmol mol-1)環(huán)境中，這有助于誘導氣孔開放。

環(huán)境空氣與葉室之間的溫差較大

測量空氣的溫度與葉室控制溫度之間的差異過大，有可能導致冷凝或無法達到足夠低的VPD_leaf以確保氣孔開放。此外，由于葉片熱電偶測得的溫度會受到周圍空氣溫度的影響，因此葉室內空氣與葉片之間較大的溫度梯度可能會導致T_leaf不正確。通過使所有系統(tǒng)組件盡可能接近設定的T_leaf，可將這些問題降至最低。如果要在環(huán)境條件之外空間內進行測量，則應將整個氣體交換系統(tǒng)和測量頭置于氣候受控的空間內，如生長室或培養(yǎng)箱。這樣就可以將IRGA周圍的溫度設定在接近T_leaf的范圍內，從而最大限度地減少溫度梯度和冷凝現象，并擴大測量的溫度范圍。

熱電偶接觸葉片的位置

葉片熱電偶必須正確安裝，并在測量時接觸葉片背面。如果不接觸葉片，熱電偶將測量葉室內的空氣溫度。如果推得太遠，可能會撕裂葉片并弄彎熱電偶。對于較大的葉室，單個熱電偶可能不足以捕捉整個葉片的異質性，如果可以，請使用第二個熱電偶。計算g_s和C_i等許多參數都需要精確測量葉片溫度，熱電偶位置不正確或損壞會導致曲線擬合中光合作用能力的估算不正確。在無法接觸葉面的情況下，可采用能量平衡法估算參數。

晝夜節(jié)律效應

許多物種以晝夜為周期進行光合作用，有些物種由于氣孔關閉或在高溫和強光條件下光保護或光抑制作用增強，中午光合作用明顯減弱。在比較不同樣品的光合作用能力時，應確保在g_s不會過度限制光合作用時(即氣孔基本開放時)進行測量。事先觀察相關物種g_s的晝夜變化規(guī)律，在一天中進行多組調查測量，有助于確定一天中什么時間最適合進行測量。

測量原位葉片與離體葉片

最好測量原位葉片，因為剪切葉片會導致葉片水勢迅速發(fā)生變化，從而影響蒸騰和氣孔導度反應。對于特定處理(如施用激素)或由于樣品本身的特性限制(如大樹冠層的葉片)，可使用離體的葉片進行測量，但應注意對此類結果的解釋，尤其是那些依賴于g_s的結果。

重要提醒
原文頁面的補充材料里有光合作用氣體交換測量的實驗流程，包含一般調查測量，A/C_i曲線(CO₂響應曲線)，A/I_inc曲線(光響應曲線) ，A/T曲線(溫度響應曲線) ，Laisk方法測量光照下葉片的表觀呼吸速率和無呼吸作用時的細胞間CO₂補償點， Kok方法測量 光照下葉片的表觀呼吸速率R_light以及其他常用光合作用氣體交換測量方法的流程。
 

由于相關文章內容非常專業(yè)，難免有些理解不準確或者編輯整理的疏漏。另外，本翻譯稿省略了文中的參考文獻、擴展閱讀、縮寫注釋。因此強烈建議感興趣的老師和同學閱讀原文(OA)。
 

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