乳腺癌細(xì)胞與造血細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的連續(xù)共培養(yǎng)獲得異質(zhì)性

乳腺腫瘤細(xì)胞從原發(fā)性部位的親本細(xì)胞擴(kuò)散為異質(zhì)性細(xì)胞群，如轉(zhuǎn)移性腫瘤。異質(zhì)性進(jìn)展是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過(guò)程，涵蓋了腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的整個(gè)臨床史，由腫瘤細(xì)胞和旁觀者細(xì)胞（bystander cell）之間的相互作用所驅(qū)動(dòng)。腫瘤微環(huán)境的各種固有細(xì)胞（resident cell）類(lèi)型都與此有關(guān)。例如：造血譜系的細(xì)胞在此過(guò)程中起著驅(qū)動(dòng)作用；骨髓造血干細(xì)胞生態(tài)位是異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞存活和定植的適宜空間。另一種重要的旁觀者細(xì)胞類(lèi)型，即間充質(zhì)干細(xì)胞/基質(zhì)細(xì)胞（MSCs），可能被吸引到腫瘤微環(huán)境中成為腫瘤相關(guān)的成纖維細(xì)胞，通過(guò)影響腫瘤細(xì)胞存活、治療耐藥性、血管生成和免疫逃逸來(lái)促進(jìn)異質(zhì)性進(jìn)展。最重要的是，骨髓源性間充質(zhì)干細(xì)胞（BM-MSCs）通過(guò)促進(jìn)異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞定植和增殖來(lái)調(diào)節(jié)骨轉(zhuǎn)移。由于腫瘤異質(zhì)性進(jìn)展和轉(zhuǎn)移涉及與多種旁觀者固有細(xì)胞類(lèi)型的相互作用，因此需要合適的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛠?lái)剖析乳腺癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的機(jī)制。

目前的研究使用各種共培養(yǎng)模型來(lái)研究腫瘤和間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用。研究發(fā)現(xiàn)，在共培養(yǎng)過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞與旁觀者細(xì)胞融合可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性。這些結(jié)果表明，腫瘤微環(huán)境中的旁觀者細(xì)胞在異質(zhì)性進(jìn)展中起著決定性作用，并且與BM-MSCs的相互作用是腫瘤細(xì)胞獲得骨轉(zhuǎn)移潛力的直接途徑。

在美國(guó)西達(dá)賽奈醫(yī)療中心（Cedars-Sinai Medical Center）團(tuán)隊(duì)的一項(xiàng)研究中，課題人員研究了另一個(gè)浸潤(rùn)腫瘤微環(huán)境的重要旁觀者細(xì)胞群——造血細(xì)胞（HCs），是否可以與腫瘤細(xì)胞相互作用以促進(jìn)異質(zhì)性進(jìn)展。實(shí)驗(yàn)用紅色熒光蛋白（RFP）標(biāo)記的人乳腺癌 MCF-7 細(xì)胞首先與 HCs共培養(yǎng)，然后與 BM-MSCs 共培養(yǎng)，通過(guò)腫瘤細(xì)胞中穩(wěn)定的形態(tài)學(xué)、行為和蛋白質(zhì)表達(dá)變化證實(shí)了旁觀者細(xì)胞在腫瘤異質(zhì)性進(jìn)展中的作用。具體研究?jī)?nèi)容發(fā)表在 CELLS 期刊題為“Breast Cancer MCF-7 Cells Acquire Heterogeneity during Successive Co-Culture with Hematopoietic and Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem/Stromal Cells”。

造血譜系的細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中旁觀者細(xì)胞的重要組成部分，因?yàn)楦鞣N類(lèi)型的 HCs都是腫瘤浸潤(rùn)細(xì)胞并顯示出轉(zhuǎn)移趨向性。研究人員通過(guò)進(jìn)行一系列的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，選擇了具有代表性的紅色熒光蛋白（RFP）標(biāo)記的克隆RMCF7-2用于后續(xù)研究。

首先，通過(guò)將不同類(lèi)型（健康供體和乳腺癌患者的PBMCs）的 HCs 與RMCF7-2 細(xì)胞單層進(jìn)行共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)與不同HCs共培養(yǎng)均可導(dǎo)致RMCF7-2 細(xì)胞的形態(tài)和行為變化。例如，在與乳腺癌患者的PBMCs共培養(yǎng)中，單層中的單個(gè)RMCF7-2細(xì)胞在第一周內(nèi)會(huì)收縮，彼此失去接觸，同時(shí)出現(xiàn)懸浮的大而圓的紅色熒光細(xì)胞。第二周，附著的RMCF7-2細(xì)胞數(shù)量減少，大部分細(xì)胞脫離，采用懸浮生長(zhǎng)（圖1）。這說(shuō)明，上皮細(xì)胞RMCF7-2與HCs共培養(yǎng)后采取懸浮生長(zhǎng)的模式。

細(xì)胞間接觸的喪失似乎是一種先天或程序性的反應(yīng)，因?yàn)樵赗MCF7-2細(xì)胞與所有11種人類(lèi)和6種小鼠HCs 共培養(yǎng)中也觀察到相同的反應(yīng)。這一系列的共培養(yǎng)物表明，無(wú)論使用哪種類(lèi)型的HCs，RMCF7-2細(xì)胞都會(huì)以相似的形態(tài)和行為變化做出反應(yīng)。由此可見(jiàn)，直接接觸存活的HCs能夠誘導(dǎo)RMCF7-2細(xì)胞改變形態(tài)和生長(zhǎng)行為。

圖1 RMCF7-2 與 HCs 共培養(yǎng)過(guò)程中的形態(tài)和生長(zhǎng)行為。

為了評(píng)估觀察到的變化是短暫的還是永久性的，使用 G418（300 μg/mL）處理共培養(yǎng)物清除剩余的 HCs，留下懸浮的紅色熒光細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)來(lái)自共培養(yǎng)物的紅色熒光細(xì)胞在第 15 次傳代后仍保持增殖，表明獲得性懸浮生長(zhǎng)是一種穩(wěn)定的表型。然后建立了用于詳細(xì)分析的克隆細(xì)胞（MAF-2 和MAF-12）（圖2），進(jìn)行持續(xù)的傳代以進(jìn)一步評(píng)估克隆細(xì)胞在懸浮生長(zhǎng)中的穩(wěn)定性。盡管這些懸浮的衍生克隆的生長(zhǎng)速度通常比親本RMCF7-2細(xì)胞慢，但都沒(méi)有失去懸浮生長(zhǎng)的跡象。因此，HC樣形態(tài)和懸浮液生長(zhǎng)的獲得特征是相當(dāng)穩(wěn)定的。

接下來(lái)，為了描述伴隨形態(tài)和行為轉(zhuǎn)換的基因表達(dá)變化，實(shí)驗(yàn)通過(guò)MCF-7細(xì)胞標(biāo)記蛋白來(lái)檢測(cè)分離的衍生克隆細(xì)胞，蛋白質(zhì)印跡法鑒定實(shí)質(zhì)性的表達(dá)變化。結(jié)果觀察到，第30次傳代的 MAF-2和 MAF-12克隆表達(dá)顯著降低的 ERα。另一個(gè)突出的變化是PR表達(dá)的丟失。相比之下，盡管EGFR1水平升高，但ERβ或Her2/neu水平幾乎沒(méi)有變化。有趣的是，當(dāng)這些細(xì)胞放棄上皮形態(tài)時(shí)，大量的E-cad持續(xù)存在，盡管水平較低，而在這些細(xì)胞中未檢測(cè)到波形蛋白。從第30代到第60次傳代，表達(dá)變化持續(xù)存在。這些結(jié)果表明，穩(wěn)定的表型轉(zhuǎn)換伴隨著基因表達(dá)的穩(wěn)定變化。

圖2 將RMCF7-2與乳腺癌患者PBMCs 共培養(yǎng)分離的MAF-2和MAF-12克隆以1:5的重復(fù)比例進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)。在傳代60次時(shí)拍攝細(xì)胞圖像。

乳腺癌經(jīng)常轉(zhuǎn)移到骨骼。在此過(guò)程中，轉(zhuǎn)移細(xì)胞可能會(huì)與不同的旁觀者細(xì)胞（包括BM-MSCs）發(fā)生連續(xù)相互作用。因此，實(shí)驗(yàn)將克隆的 MAF-2 與 MAF-12 細(xì)胞和 hBM-MSCs 進(jìn)行了另一輪共培養(yǎng)，并監(jiān)測(cè)共培養(yǎng)中的細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)行為。

第二輪共培養(yǎng)的觀察結(jié)果顯示，懸浮生長(zhǎng)中的MAF-2和MAF-12細(xì)胞在基質(zhì)單層存在下恢復(fù)了附著生長(zhǎng)。腫瘤細(xì)胞和hBM-MSCs之間經(jīng)常發(fā)生細(xì)胞融合事件（圖3A），表現(xiàn)為紅色熒光細(xì)胞，但具有hBM-MSCs形態(tài)。在第三周，紅色熒光細(xì)胞開(kāi)始成群出現(xiàn)，很可能是因?yàn)榭寺�擴(kuò)增（圖3 B）。這些細(xì)胞呈短紡錘形，沒(méi)有細(xì)胞間接觸，分散排列或重疊生長(zhǎng)，而一些附著生長(zhǎng)的細(xì)胞仍然保持圓形細(xì)胞形狀（圖3 A、B）。在4 周的共培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，hBM-MSCs 單層細(xì)胞充滿(mǎn)了異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞簇，代表具有不同克隆形態(tài)和生長(zhǎng)行為的單個(gè)紅色熒光克隆。這些結(jié)果再次證明，與旁觀者細(xì)胞的相互作用改變了腫瘤細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)行為。由于腫瘤-間充質(zhì)干細(xì)胞相互作用發(fā)生在單個(gè)細(xì)胞之間，因此這種相互作用可能會(huì)單獨(dú)影響癌細(xì)胞，從而導(dǎo)致克隆間異質(zhì)性。

圖3 與 hBM-MSCs 進(jìn)行第二輪共培養(yǎng)，使 MAF-2 和 MAF-12 細(xì)胞的附著生長(zhǎng)行為發(fā)生改變。

為了分離與 hBM-MSCs 共培養(yǎng) 4 周后恢復(fù)附著生長(zhǎng)的紅色熒光癌細(xì)胞，加入 G418 以清除基質(zhì)細(xì)胞，然后進(jìn)行克隆，報(bào)告顯示了MAF-2與hBM-MSCs共培養(yǎng)的5個(gè)克隆細(xì)胞（MAF-BMSC-1—5）的形態(tài)。不同的形態(tài)和恢復(fù)的附著生長(zhǎng)行為是穩(wěn)定的。然后進(jìn)行了另一輪蛋白質(zhì)印跡分析以評(píng)估標(biāo)記蛋白表達(dá)的狀態(tài)。盡管重新采用了附著生長(zhǎng)，但所有五個(gè) MAF-BMSC 克隆都更接近親本 MAF-2 細(xì)胞的表達(dá)模式，顯示 ERα 表達(dá)降低、PR 表達(dá)丟失和 EGFR1 水平升高。但E-cad水平仍然很低，波形蛋白仍然檢測(cè)不到。因此，從第二輪共培養(yǎng)中分離的克隆與親本 MAF-2 和祖代 RMCF7-2 細(xì)胞都具有離散的異質(zhì)性。

最后，實(shí)驗(yàn)評(píng)估了連續(xù)共培養(yǎng)是否會(huì)導(dǎo)致與親代細(xì)胞行為異質(zhì)性的癌細(xì)胞變化。與RMCF7-2細(xì)胞相比，從連續(xù)共培養(yǎng)（MAF-BMSC-1、-3和-5）中選擇的克隆細(xì)胞均顯示出更快的細(xì)胞增殖（圖4 A）、更高的遷移能力（圖4 B）和較大的異種移植腫瘤形成（圖4 C），盡管行為變化在克隆細(xì)胞之間的程度不同。有趣的是，MAF-2 和 MAF-12 的增殖和遷移都很緩慢（圖4 A、B），而使用相同接種方案的重復(fù)動(dòng)物研究表明 MAF-2 和 MAF-12 細(xì)胞不能形成異種移植腫瘤（圖4 C）。因此，未來(lái)需要進(jìn)一步檢查以確定RMCF7-2和HC共培養(yǎng)的其他克隆細(xì)胞是否也失去了異種移植腫瘤形成的潛力。

圖4 與旁觀者細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)行為異質(zhì)性。將選定的MAF-BMCS克�。�-1、-3和-5）與親本MAF克�。�-2和-12）和祖本RMCF7-2克隆的行為變化進(jìn)行比較。

總之，該研究使用連續(xù)共培養(yǎng)來(lái)模擬骨腫瘤微環(huán)境中癌細(xì)胞與浸潤(rùn)的HCs和固有BM-MSCs的相互作用，表明在連續(xù)共培養(yǎng)下，與旁觀者細(xì)胞的相互作用會(huì)引起永久性的形態(tài)學(xué)、生長(zhǎng)行為和基因表達(dá)變化，這是研究乳腺癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性的有力模型。與這項(xiàng)研究相關(guān)的是，需要對(duì)其他 MAF 克隆進(jìn)行額外的行為分析，以確定 RMCF7-2 和 HCs 之間的共培養(yǎng)是否使懸浮液中的所有癌細(xì)胞在相同參數(shù)下侵襲性降低，還需要分析其他基因表達(dá)變化，以揭示第二輪共培養(yǎng)后新獲得的侵襲性的其他伴隨表達(dá)變化。腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性證實(shí)了乳腺癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的過(guò)程，腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性處于動(dòng)態(tài)狀態(tài)，最有可能由腫瘤細(xì)胞和旁觀者細(xì)胞之間的持續(xù)相互作用來(lái)維持。闡明腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性進(jìn)展的機(jī)制是腫瘤轉(zhuǎn)移研究的目標(biāo)。

參考文獻(xiàn)：Wang R, Wang X, Yin L, Yin L, Chu GC, Hu P, Ou Y, Zhang Y, Lewis MS, Pandol SJ. Breast Cancer MCF-7 Cells Acquire Heterogeneity during Successive Co-Culture with Hematopoietic and Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem/Stromal Cells. Cells. 2022 Nov 10;11(22):3553. doi: 10.3390/cells11223553. PMID: 36428982; PMCID: PMC9688235.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36428982/

小編旨在分享、學(xué)習(xí)、交流生物科學(xué)等領(lǐng)域的研究進(jìn)展。如有侵權(quán)或引文不當(dāng)請(qǐng)聯(lián)系小編修正。如有任何的想法以及建議，歡迎聯(lián)系小編。感謝各位的瀏覽以及關(guān)注！
微信搜索公眾號(hào)“Naturethink”，了解更多細(xì)胞體外仿生培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用。

點(diǎn)擊了解
細(xì)胞流體剪切力|共培養(yǎng)|壓力培養(yǎng)|牽張應(yīng)變|血管培養(yǎng)|平行平板流動(dòng)腔|儀器|上海泉眾機(jī)電科技有限公司Naturethink
http://www.naturethink.com/

Naturethink多細(xì)胞培養(yǎng)|共培養(yǎng)體系|共培養(yǎng)模型|共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)|動(dòng)態(tài)細(xì)胞共培養(yǎng)|仿血流多細(xì)胞動(dòng)態(tài)共培養(yǎng)系統(tǒng)
http://www.naturethink.com/?product/81.html