幾種常見肝臟疾病的動物造模方法總結
“肝”不動了？肝臟疾病的發(fā)展竟然這么多學問？一文講清關于肝臟疾病的造模方法。
NAFLD，非酒精性脂肪性肝病，是指沒有酒精濫用史的患者肝臟中脂肪堆積過多的一種疾病。NAFLD 分為單純性脂肪變性和非酒精性脂肪性肝炎 (Nonalcoholic steatohepatitis，NASH)。目前，基因模型、飲食模型、化學模型等已被廣泛用于 NAFLD 的臨床前研究中[5][6]。
圖 2. 臨床前研究的 NAFLD 模型[7]。
在 NASH 中，不僅存在脂肪變性還存在小葉內炎癥和肝細胞球囊化，常伴有進行性纖維化。長期存在的 NASH 可能發(fā)展為肝硬化，肝細胞癌。飲食模型是 NASH 研究中常用模型。C57BL/6 小鼠、Wistar 大鼠和 Sprague Dawley 大鼠由于其固有的肥胖、DM2 和 NAFLD 傾向而作為 NAFLD/NASH 造模的首選模式動物。發(fā)病時間以及伴隨代謝特征的程度取決于物種、品系、性別、腸道微生物群的組成以及所采用的飲食干預[5]。
DEN 是一種基因毒性致癌物，被廣泛用于誘導嚙齒動物 HCC。單次 DEN 的 HCC 形成時間不僅與劑量有關，還與年齡、性別和遺傳背景等因素有關。研究表明，雌性小鼠對 DEN 驅動的肝癌發(fā)生具有很大的抵抗力[18]。當小鼠長期反復暴露于 DEN 時，100% 的雄性小鼠而只有 30% 的雌性小鼠發(fā)生肝臟腫瘤。與成年小鼠相比，幼齡小鼠的 HCC 誘導率更高。對于不能通過單一 DEN 誘導 HCC 的成年小鼠，需要使用其他腫瘤促進劑，如四氯化碳 (CCl4)、苯巴比妥和高脂肪飲食喂養(yǎng)[19]。此外，DEN 與 CCl4 聯(lián)合誘導可改善傳統(tǒng)化學誘導耗時較長的缺點，而且更好地模擬了人類肝癌的發(fā)展過程。
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人類肝癌的發(fā)生通常繼發(fā)于慢性肝病 (Chronic liver disease, CLD)，如酒精性脂肪性肝病 (Alcohol-related fatty liver disease, AFLD) 和非酒精性脂肪性肝病 (Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)。AFLD 和 NAFLD 二者有相似的病理譜，慢性病理性損傷可導致過度纖維化、肝硬化并最終導致肝細胞癌 (Hepatocellular carcinoma, HCC)[1]。
圖 1. 肝臟疾病的發(fā)展階段[1]。
▐ 酒精性肝病模型
酒精對酒精性肝病 (ALD) 的發(fā)生和進展的影響與飲酒的量和持續(xù)時間成正比[2]。研究慢性酒精濫用最常用的動物模型是 Lieber-DeCarli 液體飲食模型、灌胃乙醇模型和飲用水酒精模型[2]。
Lieber-DeCarli 液體飲食法是將酒精加入完全液體飲食中來喂養(yǎng)，研究者可以根據(jù)需求進行營養(yǎng)元素的調整。動物除了含有乙醇的液體飼料外沒有任何食物或飲料。這種造模方法會導致早期肝損傷，不會發(fā)展到 ALD 的最嚴重階段。灌胃乙醇輸注模型是將酒精直接注射到胃中。該模型可以維持高血液酒精濃度，并產生顯著的肝損傷。然而，這種造模方法較昂貴，對實驗操作人員的技能有嚴格要求。
圖 2. 長期植入胃導管的小鼠[3]。
飲用水中的酒精模型最接近地模擬了依賴酒精的人類飲酒模式，操作簡單，目前被廣泛應用，并且可以與其他輔助因子 (如鐵、高脂飲食、維生素補充、LPS 注射) 誘導其他進行性肝病[4]。
圖 2. 慢性酒精給藥誘導 12 月齡小鼠肝脂肪變性[2]。
酒精處理小鼠或對照小鼠的肝臟，以及酒精處理小鼠或對照小鼠的 HE 染色和油紅 0 染色肝臟切片。
▐ NAFLD 模型NAFLD，非酒精性脂肪性肝病，是指沒有酒精濫用史的患者肝臟中脂肪堆積過多的一種疾病。NAFLD 分為單純性脂肪變性和非酒精性脂肪性肝炎 (Nonalcoholic steatohepatitis，NASH)。目前，基因模型、飲食模型、化學模型等已被廣泛用于 NAFLD 的臨床前研究中[5][6]。
圖 2. 臨床前研究的 NAFLD 模型[7]。表 1. 常用的飲食模型[5][8]。
肝纖維化的主要原因包括酗酒、慢性肝炎病毒感染和非酒精性脂肪性肝炎，可發(fā)展為肝硬化甚至肝細胞癌 (HCC)。利用化學手段進行肝纖維化及晚期肝病誘導是目前臨床前研究的常用模型。化學藥物進入肝細胞產生毒性代謝物，引起肝持續(xù)損傷，誘導肝臟疾病的發(fā)生。乙醇、四氯化碳 (CCl4)、硫代乙酰胺 (TAA)、二甲基亞硝胺 (DMN)、二乙基亞硝胺 (DEN) 等肝臟毒素是常用的化學誘導劑[8]。在大多數(shù)情況下，腹腔注射這些化學物質會在相對短期內引發(fā)肝纖維化；口服或者吸入會需要更長的發(fā)展周期。
CCl4 是嚙齒類動物肝纖維化和肝硬化研究中應用最廣泛的肝毒素，其造成的損傷類似于人類肝纖維化的重要特性，包括炎癥、再生和纖維形成，常用于研究急性肝損傷、晚期肝纖維化及纖維化逆轉。CCl4 模型適用于大鼠和小鼠，但小鼠由于CCl4 代謝率更高成為造模的首選。小鼠對 CCl4 誘導的肝纖維化的易感性是菌株依賴性的，與 C57BL/6 和 DBA/2 相比，BALB/c 小鼠在 CCl4 給藥后表現(xiàn)出更多的肝纖維化病理特征[9]。CCl4 誘導的肝纖維化模型具有很高的可重復性，因此是藥物篩選的絕佳候選者。
表 2. 常見化學誘導肝臟疾病模型。
| Carbon tetrachloride 四氯化碳 通過交感神經通路誘導急性肝損傷。引起肝纖維化和肝毒性，廣泛用于肝臟疾病造模。 |
| Thioacetamide，TAA 一種間接的肝毒素，可引起實質細胞壞死。 |
| Dimethylnitrosamine，DMN 一種強效的肝毒素、致癌劑和誘變劑。 |
| N-Nitrosodiethylamine，DEN 一種有效的致癌物質二烷基硝胺。 |
| Aflatoxin B1，黃曲霉毒素 一類 1A 級致癌物質，是 Aspergillus flavus 和 A. parasiticus 的次生代謝產物。 |
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