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貼壁細胞培養(yǎng)五大難題原因及解決發(fā)法

瀏覽次數(shù)：1241　發(fā)布日期：2024-4-24　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

貼壁細胞（adherent cells），這類細胞的生長必須有可以貼附的支持物表面，如：培養(yǎng)（瓶）器皿壁上，細胞依靠自身分泌的或培養(yǎng)基中提供的貼壁因子才能在該表面上生長，繁殖。細胞一經(jīng)貼壁就迅速鋪展，然后開始進行有絲分裂，并很快進入對數(shù)生長期。

當細胞在該表面生長后，一般形成兩種形態(tài)，即成纖維樣細胞性或上皮樣細胞。貼壁細胞生長過程分為五個時期，分別是游離期、貼壁期、潛伏期、對數(shù)期、平臺期和衰退期。

貼壁細胞因其培養(yǎng)過程較為繁瑣，所以培養(yǎng)時更容易出現(xiàn)問題。今天，就圍繞貼壁細胞培養(yǎng)中常見的5大常見問題，與大家一起探討詳細原因和解決方法。

一，傳代后部分細胞漂浮

原因及解決方法如下

1，傳代前細胞密度太大：：一般細胞融合度達到80%時就可以進行傳代操作了，傳代密度需適中，傳代密度過高也會導致傳代后漂浮；

2，細胞狀態(tài)不好：可通過提高血清比例、穩(wěn)定培養(yǎng)環(huán)境等方法進行改善；

3，吹打次數(shù)過多造成機械損傷：輕柔吹打，細胞呈單顆粒時可停止吹打，吹打過程避免氣泡產(chǎn)生；

4，培養(yǎng)基更換后不適應：更換回原來的培養(yǎng)基；或者與原培養(yǎng)基比例混合后使用，使細胞有個適應期；

5，培養(yǎng)液配制、儲存不當，如pH值過堿，Gln量太少等原因；

6，接種細胞數(shù)目太少，無法分泌足夠的細胞外基質；

7，復蘇時處理速度太慢，復蘇過程不當。

二，傳代后細胞變形

原因及解決方法如下

1，變形，但細胞還在生長：可能是血清批次不一樣導致，血清成分復雜，不同批次和品牌間均存在成分差異，影響細胞狀態(tài)。建議使用同一批次血清，更換血清時需與原血清比例混合后使用，使細胞有過渡期；

2，變形，但細胞不長，且碎片增多：可能傳代操作過程損傷，常見于消化不當，或者潛在支原體等污染導致細胞病態(tài)；消化時間根據(jù)每個細胞的狀態(tài)來調整，消化過度或者消化不充分均會對細胞造成影響；培養(yǎng)過程應嚴格無菌操作，實驗環(huán)境盡量潔凈，確保細胞無外源污染。

三，細胞生長周期變慢，邊養(yǎng)邊漂

原因及解決方法如下

1，細胞傳代時密度太稀或太密：建議細胞融合度達80%左右進行傳代，傳代密度適中，密度過低會延長生長周期，密度過高會有接觸抑制；

2，傳代操作不當：根據(jù)細胞特性決定細胞消化時間，一般在顯微鏡下觀察細胞回縮變圓并有少量細胞脫落即可終止消化，難消化的細胞可分次消化，每次時間不超過5min；頻繁換液或者清洗細胞也會導致細胞狀態(tài)變差，常規(guī)換液時間間隔為2~3天。

四，傳代后細胞成團

解決方法如下

1，低密度接種，延長換液時間，防止細胞脫落；

2，使用多聚賴氨酸包被培養(yǎng)器皿，以增加細胞貼壁牢固度，降低細胞聚集成團的幾率；

3，重新鋪板，并更換新配制的培養(yǎng)基，加大血清比例（增加比例不超過5%）；

4，接種時，減少培養(yǎng)基量（如T25加3mL）以加快細胞貼壁速度，等待細胞貼壁后（約8-12小時），再補加培養(yǎng)基到正常用量。

五，細胞出現(xiàn)空泡

原因及解決方法如下

1，正常的細胞活動：有的細胞有正常的自噬行為或其他膜泡活動，無需特殊處理（如Caco-2細胞）；

2.血清不適應、培養(yǎng)基成分改變、換液不及時等造成細胞營養(yǎng)不良：可通過更換更合適的血清或及時換液等方法解決；

3，機械損傷、PH偏高或偏低等造成細胞受損：注意培養(yǎng)條件及操作手法。

六，如何促進細胞貼壁

1，適度消化細胞：HepG-2、A549、Hela、SGC-7901幾種癌細胞處理時間可適當放長，一般處理5-6min，C2C12、COS-7、NIH-3T3比較容易脫落，2min足矣，P19Cl6和293細胞貼壁不緊，可在PBS漂洗后，直接換新鮮培養(yǎng)基打散。

2，最好用塑料瓶培養(yǎng)，如果是玻璃瓶,那么可以用鼠尾膠原包被一下培養(yǎng)瓶，或者用鹽酸對培養(yǎng)瓶進行蝕刻，或者涂Laminin/fibronectin/collagen/BSA，也可以幫助細胞貼附新的培養(yǎng)瓶，細胞不易貼壁，建議加多聚賴氨酸處理。

3，正確配制消化液或培養(yǎng)液。

4，使用合適的細胞外基質或貼壁試劑。

5，復蘇新的細胞，第一周用20%血清幫助細胞復原。

6，傳代接種一定要鋪的均勻，避免細胞抱團生長。

7，細胞傳代24小時之內，最好不要晃動，以免影響貼壁。

8，體內上皮細胞生長在膠原構成的基膜上，因此培養(yǎng)在有膠原的底物上有利于生長。人或小鼠表皮細胞培養(yǎng)，可以用γ射線照射后的3T3細胞為飼養(yǎng)層，另外降低pH、Ca2+含量和溫度，均有利于上皮細胞生長。

逐典TrypLUS消化液是一種胰蛋白酶類似物（Trypsin Like Enzyme），是一種通過生物工程制備的非動物源性重組蛋白酶，與胰蛋白酶有相似的解離動力學，穩(wěn)定性更高，純度更好，消化更溫和，細胞毒性更低。目前主要應用于細胞培養(yǎng)中，可以在賴氨酸和精氨酸的C末端切割肽鍵，可以替代豬或牛胰蛋白酶（Trypsin）對貼壁細胞的消化解離。生物制藥中，GMP級別的TrypLUS能夠為疫苗生產(chǎn)、病毒載體生產(chǎn)提供高質量和高性價比的貼壁細胞消化解決方案。