RT-RPA-PfAgo系統(tǒng)：一種快速靈敏的水稻感染病毒多重檢測方法
水稻被認為是世界上重要的作物之一，由于無法獲得特定的抗病毒藥物，水稻病毒管理面臨重大挑戰(zhàn)，需要及早進行田間檢測。目前，檢測水稻病毒的主要方法包括電子顯微鏡、血清學檢測和分子生物學技術，如逆轉錄聚合酶鏈反應 (RT-PCR) 和實時熒光定量PCR。血清學方法雖然被廣泛使用，但往往靈敏度較低，導致頻繁的假陰性。電子顯微鏡和先進的分子技術都需要專門昂貴的設備，如電子顯微鏡和熱循環(huán)儀，以及熟練的實驗室人員，這限制了它們的廣泛應用。
基于核酸診斷的出現引入了重組酶聚合酶擴增 (RPA) 和環(huán)介導等溫擴增 (LAMP) 檢測等創(chuàng)新方法。這些測定通常使用專門設計的引物進行，以識別靶標的獨特序列，在等溫條件下運行，無需熱循環(huán)。特別是LAMP已被證明可有效識別各種水稻病毒，包括RRSV、RBSDV和RGSV。盡管RPA和LAMP都適合進行現場檢測，但它們的靈敏度過高，容易受到污染，并且在現場環(huán)境中執(zhí)行單管多重檢測時面臨困難。
CRISPR/Cas 系統(tǒng)作為核酸檢測診斷的有效技術，巧妙地克服了與等溫擴增技術相關的局限性，基于CRISPR-Cas13a和CRISPR-Cas12a開發(fā)的平臺已被證明可以在即時環(huán)境中快速、靈敏和特異性地檢測廣譜病原體，包括病毒RNA和DNA。然而，CRISPR-Cas檢測技術一直存在各種限制，例如原間隔區(qū)相鄰基序 (PAM) 或原間隔區(qū)側翼序列 (PFS) 的限制檢測序列以及與多重目標檢測相關的問題。
而與Cas核酸酶相比，某些pAgo蛋白具有序列特異性結合和切割靶DNA和RNA的能力。它們不受靶DNA中PAM序列存在的限制，因此在靶核酸選擇方面提供了更大的靈活性。與需要長RNA向導的Cas核酸酶相比，大多數pAgo蛋白使用短DNA分子作為向導。鑒于DNA合成相對于RNA的經濟性和穩(wěn)定性優(yōu)勢，它促進了基于Ago的核酸檢測系統(tǒng)的發(fā)展。與Cas9相比，由于它們的分子量較低，修飾和生產相對容易。
此外，它們還可以切割特定的底物序列，能夠檢測多個靶標，這些靶標已被轉化為各種新型核酸檢測例如Argonaute (TtAgo) 已被設計用于在PCR擴增后富集稀有核酸。同樣，在病毒檢測領域，Pyrococcus furiosus Argonaute (PfAgo) 系統(tǒng)切割已被用于促進對各種病毒的序列特異性檢測，如人瘤病毒、SARS-CoV-2和流感病毒。
近期中國計量大學孫凱團隊開發(fā)了一種高度特異性和靈敏度的方法，結合 PfAgo 和等溫 RPA 擴增(RT-RPA-PfAgo)，同時檢測多種病毒，該方法在特異性、靈敏度和重現性方面優(yōu)于RT-PCR，靈敏度范圍為 3.13 至 5.13 copies/μl。這項創(chuàng)新技術有望在各種植物病毒中具有潛在的適用性，從而能夠加快病毒核酸序列的鑒定。
RT-RPA-PfAgo 方法的原理
如Figure 1 所示，RT-RPA-PfAgo檢測的機制始于特定片段的 RT-RPA，然后在 5′-磷酸化 gDNA 的引導下，通過 PfAgo蛋白特異性鑒定擴增的片段。在gDNA和RPA擴增子的一條鏈之間進行堿基配對時，PfAgo觸發(fā)了靶DNA的10和11堿基之間的磷酸二酯鍵，這導致了新的5′-磷酸化ssDNA的形成，能夠作為隨后PfAgo切割的引導gDNA， 靶向合成設計的單鏈 DNA 探針，該探針在其末端用熒光團和淬滅基團標記。FAM 和 BHQ1 由于探針末端序列的發(fā)夾狀結構，因為它們具有互補性，因此保持在附近。探針的環(huán)序列被設計為與新生成的 5′-磷酸化ssDNA配對，從而通過PfAgo啟動特異性探針切割，釋放熒光團，隨后通過熒光法檢測熒光團。由不同靶標片段產生的獨特二級gDNA可指導PfAgo切割具有不同熒光標記的特定探針，從而能夠在單個反應中同時檢測多個靶標。這種雙重識別和切割過程增強了該方法的特異性和準確性，大大減少了潛在的假陽性結果。
通過RT-RPA-PfAgo建立RRSV檢測工作流程
研究者基于凝膠電泳分析、熒光探針、視覺熒光等技術構建了檢測工作流程。這些結果肯定了RT-RPA-PfAgo方法在檢測RRSV基因方面的有效性，并突出了其在病毒診斷領域的精確性和潛在適用性。
RT-RPA-PfAgo反應的優(yōu)化
為了提高RT-RPA-PfAgo反應的效率，關鍵組分的濃度，即Mn2+的濃度、gDNA 和 PfAgo 進行了優(yōu)化。結果表明，Mn2+濃度為0.8 μM時， gDNA 濃度為 2 μM 濃度時、2 μM的PfAgo被確定為最有效的濃度。優(yōu)化條件下的峰值熒光值在 PfAgo 切割后 30 分鐘內一致顯示，從而為所有后續(xù)反應選擇 30 分鐘的持續(xù)時間。
使用RT-RPA-PfAgo系統(tǒng)同時檢測RRSV、RGSV和RBSDV
基于PfAgo特異性的引導定向切割能力，進一步完善和增強了RT-RPA-PfAgo方法，實現了病毒RNA靶標的多重檢測。靶向三個特定基因片段，通過設計多重RT-RPA引物、原代gDNA和相應的探針實現了多重病毒核酸檢測。當該方法在 50 分鐘內檢測到 RRSV 的低濃度為 3.13 copies/μl、RGSV 的 4.13 copies/μl 和 RBSDV 的低濃度為 5.13 copies/μl時 。該方法在單次反應中檢測到單靶標、雙靶標和三靶標，在任何反應組合中均未出現脫靶信號，并且多重反應中的信號強度保持均勻。
通過RT-RPA-PfAgo進行現場樣品分析
為了評估三重RT-RPA-PfAgo測定對田間樣品的療效，在不同地區(qū)收集了22份水稻葉組織樣本同步檢測。研究結果表明，RT-RPA-PfAgo 和 RT 方法之間完全一致 (100%) (Figure 5) 。這些結果提倡并強調了多重RT-RPA-PfAgo檢測準確區(qū)分田間樣品中發(fā)現的各種病毒物種的能力，強調了其在植物病毒診斷中的潛在應用。
基于核酸診斷的出現引入了重組酶聚合酶擴增 (RPA) 和環(huán)介導等溫擴增 (LAMP) 檢測等創(chuàng)新方法。這些測定通常使用專門設計的引物進行，以識別靶標的獨特序列，在等溫條件下運行，無需熱循環(huán)。特別是LAMP已被證明可有效識別各種水稻病毒，包括RRSV、RBSDV和RGSV。盡管RPA和LAMP都適合進行現場檢測，但它們的靈敏度過高，容易受到污染，并且在現場環(huán)境中執(zhí)行單管多重檢測時面臨困難。
CRISPR/Cas 系統(tǒng)作為核酸檢測診斷的有效技術，巧妙地克服了與等溫擴增技術相關的局限性，基于CRISPR-Cas13a和CRISPR-Cas12a開發(fā)的平臺已被證明可以在即時環(huán)境中快速、靈敏和特異性地檢測廣譜病原體，包括病毒RNA和DNA。然而，CRISPR-Cas檢測技術一直存在各種限制，例如原間隔區(qū)相鄰基序 (PAM) 或原間隔區(qū)側翼序列 (PFS) 的限制檢測序列以及與多重目標檢測相關的問題。
而與Cas核酸酶相比，某些pAgo蛋白具有序列特異性結合和切割靶DNA和RNA的能力。它們不受靶DNA中PAM序列存在的限制，因此在靶核酸選擇方面提供了更大的靈活性。與需要長RNA向導的Cas核酸酶相比，大多數pAgo蛋白使用短DNA分子作為向導。鑒于DNA合成相對于RNA的經濟性和穩(wěn)定性優(yōu)勢，它促進了基于Ago的核酸檢測系統(tǒng)的發(fā)展。與Cas9相比，由于它們的分子量較低，修飾和生產相對容易。
此外，它們還可以切割特定的底物序列，能夠檢測多個靶標，這些靶標已被轉化為各種新型核酸檢測例如Argonaute (TtAgo) 已被設計用于在PCR擴增后富集稀有核酸。同樣，在病毒檢測領域，Pyrococcus furiosus Argonaute (PfAgo) 系統(tǒng)切割已被用于促進對各種病毒的序列特異性檢測，如人瘤病毒、SARS-CoV-2和流感病毒。
近期中國計量大學孫凱團隊開發(fā)了一種高度特異性和靈敏度的方法，結合 PfAgo 和等溫 RPA 擴增(RT-RPA-PfAgo)，同時檢測多種病毒，該方法在特異性、靈敏度和重現性方面優(yōu)于RT-PCR，靈敏度范圍為 3.13 至 5.13 copies/μl。這項創(chuàng)新技術有望在各種植物病毒中具有潛在的適用性，從而能夠加快病毒核酸序列的鑒定。
RT-RPA-PfAgo 方法的原理
如Figure 1 所示，RT-RPA-PfAgo檢測的機制始于特定片段的 RT-RPA，然后在 5′-磷酸化 gDNA 的引導下，通過 PfAgo蛋白特異性鑒定擴增的片段。在gDNA和RPA擴增子的一條鏈之間進行堿基配對時，PfAgo觸發(fā)了靶DNA的10和11堿基之間的磷酸二酯鍵，這導致了新的5′-磷酸化ssDNA的形成，能夠作為隨后PfAgo切割的引導gDNA， 靶向合成設計的單鏈 DNA 探針，該探針在其末端用熒光團和淬滅基團標記。FAM 和 BHQ1 由于探針末端序列的發(fā)夾狀結構，因為它們具有互補性，因此保持在附近。探針的環(huán)序列被設計為與新生成的 5′-磷酸化ssDNA配對，從而通過PfAgo啟動特異性探針切割，釋放熒光團，隨后通過熒光法檢測熒光團。由不同靶標片段產生的獨特二級gDNA可指導PfAgo切割具有不同熒光標記的特定探針，從而能夠在單個反應中同時檢測多個靶標。這種雙重識別和切割過程增強了該方法的特異性和準確性，大大減少了潛在的假陽性結果。
Figure 1. 用于同時檢測三個RNA靶標的RT-RPA-PfAgo示意圖
通過RT-RPA-PfAgo建立RRSV檢測工作流程
研究者基于凝膠電泳分析、熒光探針、視覺熒光等技術構建了檢測工作流程。這些結果肯定了RT-RPA-PfAgo方法在檢測RRSV基因方面的有效性，并突出了其在病毒診斷領域的精確性和潛在適用性。
Figure 2. 通過 RT-RPA-PfAgo 檢測 RSV
(A) gDNA的示意圖和為RRSV檢測量身定制的指定探針。PfAgo 切割區(qū)域和新形成的次級 gDNA 以紅色突出顯示。三個 5’ 磷酸化的單鏈 DNA 向導以紫色、綠色和黃色陰影描繪。分子信標以藍色表示和強調。(B) PfAgo 介導的 RT-RPA 衍生擴增子上的切割活性圖示，如在 3% TAE 凝膠上所示。(C) 藍光透射儀下陽性樣品的視覺熒光。(D) 通過RT-RPA-PfAgo方法對RRSV的熒光檢測顯示為熒光曲線。NTC：無模板對照。RT-RPA-PfAgo反應的優(yōu)化
為了提高RT-RPA-PfAgo反應的效率，關鍵組分的濃度，即Mn2+的濃度、gDNA 和 PfAgo 進行了優(yōu)化。結果表明，Mn2+濃度為0.8 μM時， gDNA 濃度為 2 μM 濃度時、2 μM的PfAgo被確定為最有效的濃度。優(yōu)化條件下的峰值熒光值在 PfAgo 切割后 30 分鐘內一致顯示，從而為所有后續(xù)反應選擇 30 分鐘的持續(xù)時間。
Figure 3. RT-RPA-PfAgo的優(yōu)化
(A–C) 圖說明了熒光強度的時間積累，每個圖對應于不同濃度的Mn2+gDNA 和 PfAgo。(D-F) 描述終點熒光信號的條形圖，具有不同濃度的 Mn2+、gDNA 和 PfAgo。包括誤差線，以指示三個重復中的標準誤差。RRSV RNA標準品，濃度為104在這些實驗中，每個反應的copies數被用作模板。使用RT-RPA-PfAgo系統(tǒng)同時檢測RRSV、RGSV和RBSDV
基于PfAgo特異性的引導定向切割能力，進一步完善和增強了RT-RPA-PfAgo方法，實現了病毒RNA靶標的多重檢測。靶向三個特定基因片段，通過設計多重RT-RPA引物、原代gDNA和相應的探針實現了多重病毒核酸檢測。當該方法在 50 分鐘內檢測到 RRSV 的低濃度為 3.13 copies/μl、RGSV 的 4.13 copies/μl 和 RBSDV 的低濃度為 5.13 copies/μl時 。該方法在單次反應中檢測到單靶標、雙靶標和三靶標，在任何反應組合中均未出現脫靶信號，并且多重反應中的信號強度保持均勻。
Figure 4. 評估 RT-RPA-PfAgo 檢測的三重檢測和分類能力
(A) PfAgo 介導的 RT-RPA 擴增子上的裂解，如在 3% TAE 凝膠上觀察到的那樣。(B-D) 分別使用連續(xù)稀釋的 RRSV、RGSV 和 RBSDV 進行三重熒光分析的檢測限 (LoD) 測定。圖中的誤差線表示從三次重復計算出的標準偏差。(E) 描述RRSV、RGSV和RBSDV的RT-RPA-PfAgo熒光檢測的正交特異性的熱圖。(F) 使用RNA靶標的混合物進行三重熒光分析。熱圖的顏色強度對應于在三次重復中觀察到的平均熒光強度。通過RT-RPA-PfAgo進行現場樣品分析
為了評估三重RT-RPA-PfAgo測定對田間樣品的療效，在不同地區(qū)收集了22份水稻葉組織樣本同步檢測。研究結果表明，RT-RPA-PfAgo 和 RT 方法之間完全一致 (100%) (Figure 5) 。這些結果提倡并強調了多重RT-RPA-PfAgo檢測準確區(qū)分田間樣品中發(fā)現的各種病毒物種的能力，強調了其在植物病毒診斷中的潛在應用。
Figure 5. RT-RPA-PfAgo測定與現場樣品的RT-PCR結果之間的比較
前三行顯示RT-PCR檢測結果，而熱圖顯示了從RT-RPA-PfAgo方法獲得的熒光結果。S1–S22 表示每個字段樣本。陽性對照表示為“PC”，無模板對照表示為“NTC”。
