一種高效平行純化多肽的方法介紹以實現(xiàn)快速平行純化加速藥物篩選

摘要
減少固相多肽合成（SPPS）過程產生的雜質，對于可靠的結果分析來說非常重要。然而，因為色譜純化的方式無法進行多肽平行純化，所以在進行多肽藥物篩查（N＞24）的過程中，經常會使用一些低純度的粗肽，這對最終的結果分析非常不友好。但是，目前我們使用PurePep EasyClean(PEC)技術在96孔板里進行多肽的平行純化，成功突破了這一瓶頸。

引言
在多肽藥物篩查過程中，需要測試數(shù)百種不同的多肽，這對多肽藥物的驗證或進行構效關系的研究至關重要。目前利用基于Fmoc策略的固相多肽合成（SPPS）方法可以快速合成大量多肽樣品。但是在合成過程中，由于多肽鏈的截斷或氨基酸的缺失等原因，氨基酸的偶聯(lián)效率無法達到100%，因此不可避免的會產生一些雜質，通常這些雜質我們會通過反向高效液相色譜（RP-HPLC）的方法去除。然而，反向高效液相色譜（RP-HPLC）受到通量的限制，即每個純化柱一次只能純化一個多肽。因此多肽藥物篩選主要是基于粗肽來進行，會導致分析結果假陽性或假陰性的風險大大增加，極大阻礙了多肽藥物開發(fā)的進展。在此項案例研究中，我們介紹一種可以高效平行純化多肽的方法，利用Purepep EasyClean(PEC)技術，使用多孔板和真空歧管，實現(xiàn)一次快速平行純化96個多肽（每個多肽最大10μmol），以此來推動高效可靠的多肽藥物開發(fā)工作。

方法
合成
在Ramage-Amide-DP-樹脂上以10μmol規(guī)模在96孔板中（1×45分鐘，5倍過量氨基酸）平行合成2×96個肽，然后進行常規(guī)封端反應（2M Ac2O，2M pyridine，1×5分鐘）。封端步驟可以確保PEC Linker連接子RC+（4倍當量）選擇性偶聯(lián)到目標肽上，偶聯(lián)時間2個小時（6倍當量DIPEA，6倍當量Oxyma），序列由英國Durham大學化學系Steven Cobb提供。使用TFA/H2O/EDT/PhSMe/TIS（83:5:5:5:2，每10 μmol肽0.5 mL裂解液）進行TFA裂解2h。收集粗肽，沉淀，離心并在96孔板中干燥。圖1顯示了96個序列中氨基酸的加權分布。
 

圖 1 肽庫序列示意圖

PEC純化
為了進行肽庫序列的高通量平行純化，PEC純化的操作程序適應了96孔板的使用設計。因此，在連接有Linker連接子的修飾肽溶解后，所有后續(xù)的步驟借助真空歧管在96孔板上進行，可實現(xiàn)連接子從開始偶聯(lián)到最終無痕釋放的全過程。第一個96孔板上合成的粗肽利用PEC純化技術純化，最終收集在深孔板上并直接凍干；第二個96孔板的合成的粗肽不進行PEC純化，而是裂解、沉淀、溶解在 H₂O/MeCN (7:3) + 0.1% TFA 溶液中進行分析并凍干，以確定粗純度和產量。

分析
在 Waters 的 Acquity H-Class UPLC-ESI-MS 系統(tǒng)上，利用C-18 柱（1.7 μm，2.1 x 500 mm）進行純度分析和質譜鑒定；流動相為含有 0.1% TFA 的H₂O（A）和 MeCN（B）混合液；使用已知 210 nm 處消光系數(shù)的試劑（0.1 mg/mL Fmoc-L Glutamic acid (OtBu) monohydrate solution）作為內標計算回收率。²
 

圖 2 粗品和 PEC 級 SCP12 和 SCP31 在 210 nm 處的 UPLC-UV/VIS 色譜圖

結果和討論
使用 PEC 技術可使 96 種肽的平均純度提高 19%（表 1）。

表 1 粗肽和 PEC 級肽的平均結果

利用PEC技術純化后的肽庫沒有檢測到截短序列，并且只有一種肽的純度低于 70%（圖 3）。與未純化的粗肽相比，這是一個明顯的改進，在未純化的粗肽肽庫中，只有18種肽的純度高于80%（圖3）。PEC級肽的總體回收率為48%。
 

圖 3  96種肽的粗品純度和 PEC 級純度分析

圖2顯示了兩種代表性肽的粗肽和PEC級純化肽的比較色譜圖。例如SCP31肽（圖2，左）體現(xiàn)了PEC純化技術的優(yōu)勢：可以有效去除截短序列。這個特點在未優(yōu)化的合成過程中至關重要。在肽庫的制備中，由于96條肽中有76條在其序列中具有一個 Asp-Gly 片段，雜質大部分是由天冬酰亞胺的形成而產生的，如圖 2（右）所示。平均而言，由天冬酰亞胺的形成引起的雜質占總雜質的7%。

盡管 PEC 無法完全去除這些雜質，但PEC技術純化的結果也已經表現(xiàn)了相當?shù)臐摿Γ豪�如使�?Asp(Dmb/Hmb)Gly 構建塊，將使96條肽的平行純化平均純度達到87%。

結果一覽
1. 使用 96 孔板形式的PEC純化可以實現(xiàn)大規(guī)模并行多肽純化
2. 一種方法適用于所有的程序，PEC級的肽平均純度為87%
3. 通過消除多肽相關雜質來提高檢測可信度

高通量多肽純化試劑盒
PTI（Protein Technologies, Inc.）公司的高通量多肽純化試劑盒采用獨特的PEC純化技術，進行大規(guī)模多肽快速平行純化以保證高度可靠的分析結果。一種純化方法適用于所有種類多肽純化，并且一次可平行純化48或96個多肽，平均純度高達85%以上；還可降低95%的溶劑消耗量和有機廢液的產生，極大降低純化成本，非常適合PEC級肽庫的構建，大大提高篩選和分析結果的可靠性。
 

多肽合成、切割、純化——三位一體多肽合成儀

PurePep®Chorus多肽合成儀結合了穩(wěn)定自動化的多肽合成、多肽切割及多肽純化；可先平行合成6條不同肽序，并原位切肽，然后在同一臺儀器上，平行純化6條多肽；使用感應加熱能快速合成多肽，同時正交捕獲-釋放PurePep EasyClean (PEC)技術可實現(xiàn)高效多肽純化；可有效應用于疏水肽(hydrophobic peptides)及聚集肽(aggregating peptides)的合成與純化。

參考文獻
[1] J. R. Currier et al. Clin Vaccine Immunol 2008,15, 267-276
[2] B. J. H. Kuipers; H. J. Gruppen Agr. Food Chem. 2007, 55, 5445-5451